C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位对PCV2 VLPs稳定性的影响

【目的】利用大肠杆菌原核表达系统表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及在其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap嵌合蛋白,对Cap蛋白形成的病毒样颗粒（VLPs）的稳定性、免疫原性以及C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位VLPs的热稳定性进行研究,为猪圆环病毒2型(PCV2)VLPs疫苗的高效制备及基于Cap VLPs纳米骨架展示技术嵌合疫苗的开发奠定基础。【方法】采用分子生物学方法合成PCV2b型强毒株ZJ的cap基因,在其C-端插入PRRSV T细胞抗原表位T1、T2、T3、T4、T5,构建cap-T1～cap-T5基因;将cap及cap-T1～cap-T5基因与pET28a表达载体连接,构建重组表达载体,转染大肠杆菌ClearColi^TMBL21(DE3)进行诱导表达,并对表达产物的热稳定性及免疫效果进行检测。【结果】实现了Cap蛋白及其C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的Cap-T1、Cap-T2、Cap-T3、Cap-T4和Cap-T5嵌合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,并成功观察到了VLPs;表达产物热稳定性分析显示,在60 ℃处理30 min条件下,Cap VLPs保持稳定,而C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位的VLPs热稳定性大幅下降;小鼠免疫效果检测显示,Cap VLPs诱导产生了高水平特异性抗体,其中VLPs+佐剂S350组效果最好。【结论】利用大肠杆菌表达系统表达的PCV2 Cap蛋白可高效自组装成耐热和高免疫原性的VLPs,但在Cap蛋白C-端嵌合PRRSV T细胞抗原表位后的嵌合VLPs组装效果和稳定性急剧下降,提示PCV2 VLPs作为纳米骨架用于传染病疫苗研发仍有较大局限性。     

甘胆口服液对BRD犊牛血清急性期蛋白和氧化应激指标的影响

【目的】探讨甘胆口服液按推荐剂量用药对牛呼吸道疾病（bovine respiratory disease,BRD）的治疗效果及对血清急性期蛋白（acute phase protein,APP）浓度和氧化应激指标的影响,为其在牛临床上的推广应用提供依据。【方法】选择40头自然发病的BRD犊牛,随机分成2组,分别为受试药物组（甘胆口服液0.2 mL/kg）、对照药物组（麻杏石甘散0.75 g/kg）,并增加健康犊牛12头作为空白对照组,按推荐剂量1次/d,连用7 d,分别于试验第0,3,5,7天记录犊牛的一般临床症状,并依据BRD评分表进行打分;在试验第0,7天随机抽取各试验组犊牛12头颈静脉采血,测定血清APP（结合珠蛋白（HP）、淀粉样蛋白A（SAA）、C-反应蛋白（CRP））浓度和氧化应激指标（丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC））水平。【结果】药物组试验犊牛第0天证候积分均≥5分,符合试验要求。用药第3,5,7天临床症状积分均不同程度降低（P<0.05）。在第5天时积分均<5分,第7天积分减少到最小值。麻杏石甘散组犊牛在第3天时的BRD治愈率高于甘胆口服液组（P>0.05）,但随着治疗时间的延长,甘胆口服液治愈率与麻杏石甘散相近,用药5 d后,两药物组治愈率均达到60%以上。BRD组犊牛第0天血清HP、SAA、MDA水平显著高于健康对照组（P<0.05）,GSH、T-AOC水平及SOD、CAT活性均不同程度低于健康对照组,但差异不显著（P>0.05）。经过药物治疗后,BRD组犊牛第7天血清HP、SAA、MDA水平显著下降,GSH水平和SOD活性显著上升（P<0.05）。【结论】甘胆口服液能明显改善BRD犊牛临床症状,有效缓解患BRD犊牛氧化应激状态,降低血清急性期蛋白水平。联合应用急性期蛋白和氧化应激指标可以对BRD犊牛进行早期诊断及疗效监测。     

周年轮作休耕模式对土壤球囊霉素和团聚体稳定性的影响

为探究周年轮作休耕模式对土壤球囊霉素和团聚体稳定性的影响规律与机制,通过田间试验设置苕子-玉米轮作、豌豆-玉米轮作、休闲-玉米和全年休闲4个处理,分析不同种植模式下团聚体、球囊霉素相关土壤蛋白(GRSP)及有机碳(SOC)的变化规律。结果表明:与休闲-玉米、苕子-玉米轮作、豌豆-玉米轮作相比,全年休闲能显著增加大团聚体(>0.25 mm)含量,提高团聚体稳定性;在不同团聚体粒级下,与休闲-玉米相比,苕子-玉米轮作、豌豆-玉米轮作和全年休闲均能有效增加GRSP和SOC的含量,且全年休闲效果更佳;结构方程模型的结果显示,GRSP对SOC和可溶性有机碳(DOC)有直接的正面影响,对团聚体稳定性有间接影响,各因子对平均质量直径的总效应由大到小依次为WSA_>0.25(>0.25 mm水稳性团聚体)>DOC>总GRSP>SOC>易提取GRSP;相关性分析表明,不同团聚体粒级下GRSP与SOC均呈线性正相关关系,但在不同粒级下的相关系数的大小有所差异。研究表明,合理的轮作休耕模式有助于恢复地力,改善耕地质量,减少水土流失。     

毛竹磷转运蛋白Ⅰ家族基因鉴定及表达模式

  目的  鉴定毛竹Phyllostachys edulis磷转运蛋白Ⅰ (phosphate transporter 1, PHTⅠ)家族基因,分析其表达模式。  方法  利用生物信息学方法,鉴定毛竹PHTⅠ家族成员,分析基因启动子调控元件、编码蛋白的理化性质、基因结构、氨基酸保守基序、基因在染色体的位置、组织表达特异性、基因适应性进化及系统进化等。  结果  毛竹中共鉴定出20个PHTⅠ家族基因 (PePHTs),分布在10条染色体上,均定位于细胞膜。每个基因都含有1~2个内含子,PePHTs启动子序列中包含干旱、低温等非生物胁迫以及赤霉素等激素类响应元件。毛竹PHTⅠ大部分为碱性蛋白质,分子量为48.61~76.37 kDa,理论等电点为6.84~9.30,疏水性值均大于0,都属于疏水蛋白。基因适应性进化分析显示:大多数PePHTs的选择压力值小于0,说明多数基因受到负选择压力。转录组表达图谱表明:PePHTs在不同组织中的表达存在差异性,说明该基因家族在毛竹生长发育过程中发挥着不同的作用。系统进化树表明:PePHTs都聚类在第Ⅰ亚家族,并且优先和水稻Oryza sativa聚类在同一支上。  结论  PHTⅠ家族在植物吸收和转运磷的过程中扮演了重要作用。本研究结果为深入研究毛竹PHTⅠ家族基因的功能奠定了理论基础。图5表1参45     

新型冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

[目的]当前,新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)导致的疫情在全球大流行,严重危害人类的生命健康.研究拟制备并鉴定针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白(nucleocapsid,N)的单克隆抗体,为SARS-CoV-2新型快速检测方法的创制奠定基础.[方法]纯化原核表达的SARS-CoV-2 N重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,经过4次免疫后将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,并通过western blot和间接免疫荧光试验鉴定抗体的反应性.[结果]经3次亚克隆,试验获得了2株能够稳定分泌抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2D11和8G6;并且制备的抗体与真核表达的SARS-CoV-2 N蛋白反应原性良好.[结论]研究制备的单克隆抗体能够用于SARS-CoV-2的检测.     

转谷氨酰胺酶交联大豆分离蛋白的结构变化与凝胶强度的相关性

为研究转谷氨酰胺酶交联大豆分离蛋白(SPI)的结构变化与凝胶特性之间的关系,利用SPSS软件Person分析法研究了交联后SPI结构变化与凝胶强度的相关性,发现转谷氨酰胺酶交联SPI后,其结构特征发生变化,表面疏水基团暴露,表面疏水性提高35.9％,表面巯基含量降低24.8％,二硫键含量增加10.3％,自由氨基的含量降低73.8％.相关性研究结果表明:表面疏水性含量与凝胶强度呈正相关,巯基含量与凝胶强度呈负相关,二硫键与凝胶强度呈显著正相关,自由氨基含量与凝胶强度呈显著负相关,4种结构特性对凝胶强度均有影响,表面疏水性和二硫键有利于提高凝胶强度.     

花楸树热激蛋白SpHSP70-2基因的克隆及表达分析

探究花楸树响应高温胁迫的分子机制,为遗传改良和耐热品种的选育提供基础,依托花楸树叶片转录组测序数据,采用反转录PCR（RT-PCR）方法克隆得到HSP70家族中的1个基因,命名为SpHSP70-2,同时对该基因进行了生物信息学分析,利用荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对其组织特异性和应答高温胁迫的表达模式进行了分析。结果表明,经克隆得到的SpHSP70-2基因与花楸树叶片转录组测序数据的基因序列一致,SpHSP70-2开放阅读框（ORF）长度为1 704 bp,编码567个氨基酸。SpHSP70-2蛋白具有HSP70特征结构域:核苷酸结合结构域（NBD）和底物结合结构域（SBD）;SpHSP70-2基因无内含子;SpHSP70-2二级结构中具有ɑ螺旋（32.63%）、延伸链（23.28%）、β转角（7.23%）和随机卷曲链（36.86%）;SpHSP70-2蛋白为疏水性蛋白,有11个跨膜螺旋,无信号肽;SpHSP70-2与同科的苹果、白梨的HSP70同源性最高,为90%以上;SpHSP70-2在花楸树的果实中表达量最大,在茎、根中表达量次之,在花中的表达量最小;在42℃高温胁迫处理下,SpHSP70-2表达量呈现先升高后下降趋势,在2 h时达到极值,随后表达量略缓慢下降,说明SpHSP70-2基因参与调控花楸树对高温胁迫的响应。研究结果为今后花楸树响应热胁迫的分子机制研究和引种驯化方面提供基础。     

中华绒螯蟹表皮蛋白基因EsCAP的克隆与表达分析

以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为试验对象,克隆中华绒螯蟹表皮蛋白CAP基因序列,分析其表达规律,为探索中华绒螯蟹蜕皮发生机理提供参考.运用生物信息学从中华绒螯蟹转录组数据中比对筛查表皮蛋白CAP基因序列信息,克隆扩增获得表皮蛋白CAP基因cDNA序列,运用RT-qPCR分析表皮蛋白CAP基因在不同组织、不同发育阶段和不同蜕皮时期的表达特征.结果表明,中华绒螯蟹表皮蛋白CAP基因cDNA序列全长380 bp,编码101个氨基酸,包括1个信号肽和1个R&R结合域.表皮蛋白基因CAP主要在蜕皮后期的表皮组织中表达,在蜕皮间期不表达;在不同发育阶段的仔蟹1期表达量最高,根据其发育表达模式推测表皮蛋白基因CAP参与表皮的形成和钙化,为后续深入研究表皮蛋白基因的生理功能奠定基础.     

响应面分析法优化酶法提取小米谷糠蛋白工艺

采用酶法提取小米谷糠蛋白,对小米谷糠进行脱胶、脱脂处理,以提取率为考察指标,从5种蛋白酶中筛选最适酶制剂.采用单因素试验和响应面试验优化酶的添加量、作用时间、作用温度、浸提pH值,得出对谷糠蛋白提取率的影响.结果表明,小米谷糠蛋白的最佳提取率对应的工艺条件如下:添加0.7％碱性蛋白酶,调节pH值为9,于50℃提取1.8 h,提取率为72.29％.由此可见,用碱性蛋白酶提取谷糠蛋白是一种高效的方法.     

不同蛋白水平饲料对大规格松浦镜鲤越冬后体质量损失、体成分、抗氧化及蛋白合成基因表达的影响

研究不同饲料蛋白水平(24％、26％、28％、30％、32％、34％)对大规格松浦镜鲤越冬前后生长、体成分、抗氧化及蛋白合成基因表达的影响,前期进行完大规格松浦镜鲤对饲料蛋白质适宜需要量的研究试验后,在每个网箱中保留规格齐整,质量为(694.55±64.72)g的20尾大规格鲤鱼进行越冬试验,共18个网箱(2.0 m×2.0 m×2.0 m),时间为2019年10月31日至2020年4月28日.越冬期间水温3～8℃.结果表明,26％蛋白组的体质量损失率及肥满度下降比显著低于24％、32％、34％蛋白组(P<0.05),24％蛋白组的肝体比下降比显著高于其他各组(P<0.05).各组间存活率无显著差异(P>0.05).26％蛋白组越冬后肌肉粗蛋白含量显著高于24％蛋白组,且其下降比显著低于24％蛋白组(P<0.05).24％组和32％组的肌肉水分含量显著高于26％组(P<0.05),32％组肌肉水分增加比显著高于26％和34％组(P<0.05).26％蛋白组鲤鱼肝胰脏的过氧化氢酶和过氧化物酶活性显著高于其他各组(P<0.05),超氧化物歧化酶活性显著高于30％蛋白组(P<0.05),谷胱甘肽含量显著高于24％蛋白组(P<0.05).34％蛋白组的丙二醛含量显著高于其他各组(P<0.05).26％蛋白组的越冬后肌肉雷帕霉素受体基因表达量显著高于24％、34％蛋白组(P<0.05).26％蛋白组的肌肉4E结合蛋白1基因表达量显著高于其他各组(P<0.05).26％蛋白组的肌肉S6K蛋白激酶及蛋白激酶B基因表达量显著高于除24％蛋白组外的其他各组(P<0.05).越冬试验发现,26％蛋白组鲤鱼越冬效果最佳,体质量损失率及肥满度下降比均为最低,鱼体能够储存更多的蛋白质,使机体获得较强的抗氧化能力和较低的氧化应激水平,拥有较强的自身内源蛋白质合成能力.