仿刺参微卫星标记的筛选及群体遗传结构分析

采用FIASCO(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing Repeats)方法构建了仿刺参基因组富集CA微卫星序列的基因组短片段文库,筛选得到118条微卫星DNA序列。根据重复单元的排列特点,完美型共83个,占70.4%;非完美型共30个;占25.4%;复合型标记5个,占4.2%。选取其中20条微卫星序列设计引物进行多态性检测,并利用这20对引物对采自中国、韩国(西海岸及东海岸)、俄罗斯和日本沿海的野生仿刺参以及美国沿海的具疣拟刺参进行遗传多样性水平和遗传结构分析。结果表明,所设计的20对引物的扩增产物均具有多态性,其中16个位点为高度多态(PIC>0.5)。遗传多样性分析结果显示,20个微卫星座位的平均观察杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)分别为0.39和0.69,共检测到231个等位基因(102个有效等位基因),在每个座位上获得3～20个等位基因,平均等位基因数为11.6个,20个位点在6个群体中不同程度偏离遗传平衡(P<0.05),所有群体在整体上均表现为杂合子缺失(Fis>0);5个仿刺参群体间的遗传相似系数在0.71以上,相似性较高,而仿刺参群体与具疣拟刺参的相似性则较低。聚类分析结果表明,中国群体与韩国西海岸群体聚类成一支,而俄罗斯群体、韩国东海岸群体和日本群体聚类成另外一支,聚类的先后与它们在地理分布上的海域位置有一定的相关性。     

刺参肠组织蛋白质双向电泳体系的建立及优化

以刺参肠组织为材料,通过蛋白质提取方法、上样前处理方法、上样量以及聚焦条件的优化,建立了刺参肠组织蛋白质双向电泳技术体系.试验结果表明,采用TCA-丙酮沉淀法制备刺参肠组织蛋白质,能够得到高纯度的蛋白质提取液.刺参样品上样前不经过处理,等电聚焦电压1 000V,电流7mA,聚焦时间3h,平衡时间30min,最佳上样量25μg,pH 4～6.5、8.5cm的IPG胶条,银染能获得较好的双向电泳图谱.通过蛋白质双向电泳体系的优化,获得了刺参肠组织的蛋白质表达图谱,为进一步研究刺参差异表达蛋白的筛选及蛋白质组学研究提供技术保障     

普通刺参(Apostichopus japonicus)和白刺参不同组织基因组DNA的MSAP研究

本研究分别以普通刺参(Apostichopus japonicus)和白刺参基因组DNA为实验材料,应用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术对刺参体壁、呼吸树和消化道3个组织的DNA甲基化水平和甲基化模式进行了研究,初步探讨了DNA甲基化对刺参组织间基因特异性表达的影响.结果显示,筛选得到的9对引物组合能够在普通刺参和白刺参两个群体中得到稳定扩增,在两群体刺参中分别检测到5932和5208个位点,均以未甲基化位点为主,普通刺参和白刺参未甲基化位点数分别为4317和3944,分别占总扩增条带数的72.78％和75.73％.普通刺参体壁的甲基化水平为31.07％,呼吸树为23.36％,消化道为26.34％;白刺参中体壁的甲基化水平为29.88％,呼吸树为23.25％,消化道为19.45％,由此可见,体壁的甲基化率在两群体中是最高的.普通刺参和白刺参同一组织间的甲基化水平和甲基化模式不同,同一群体体壁、呼吸树和消化道不同组织间的甲基化水平和模式也不同.甲基化在普通刺参和白刺参组织分化和发育过程中可能发挥着十分重要的作用.在检测的3个组织中,CCGG序列的全甲基化位点较半甲基化位点多.     

基于MSAP技术的刺参选育群体基因组表观与序列遗传多样性分析

抗逆选育引起的遗传变化不仅源于DNA序列的变化,也有来自于表观层面的修饰改变。为探究刺参(Apostichopus japonicus)耐高温新品系育种过程中的选育基础群体与选育群体的遗传多样性,运用MSAP技术分析了选育基础群体F、选育F1代和选育F4代的基因组遗传多样性。结果显示,10对引物获得的806个位点中,多态性位点为698个,多态性百分比达到86.60%;基于非甲基化位点的遗传分析,选育F4代香农多态性指数为0.3981,Nei基因多样度为0.2264;基于甲基化敏感位点分析,选育F4代香农多态性指数为0.5873,Nei基因多样度为0.2598,均高于基础群体;表观遗传多样性均大于非甲基化位点变异产生的序列遗传多样性,表明表观变异出现频率高于序列遗传变异。MSAP甲基化模式分析显示,选育F1和F4代经过选育后获得了一些甲基化水平和模式的改变,说明经温度胁迫选育,改变了刺参群体的基因组的甲基化状态。选育F4代获得的类型Ⅱ的条带数最多,为161条,明显高于未选育刺参,为选育获得表观遗传特征。研究结果从遗传物质基础角度揭示了选育群体的遗传改变与进展,可为抗逆新品种选育中的表观遗传研究提供参考。     

基于多个线粒体序列的中韩俄沿海不同地理群体刺参的遗传多样性及种群结构分析

为评价不同海域不同体色特征刺参群体的遗传结构,本研究采用PCR技术扩增了中国、韩国和俄罗斯沿海8个刺参(Apostichopus japonicus)群体的16S rDNA、COⅠ和D-loop序列。根据所获得的16S rDNA、COⅠ和D-loop序列分析这8个群体的遗传多样性和遗传进化关系。结果显示,16S rDNA、COⅠ和D-loop序列长度分别为543 bp、656 bp和509~527 bp。16S rDNA序列中共检测到16个多态位点,16种单倍型,单倍型多样性指数为0.629,核苷酸多样性指数为0.0016,平均核苷酸差异数0.880。COⅠ序列共检测到62个多态位点,38种单倍型,单倍型多样性指数为0.958,核苷酸多样性指数为0.0073,平均核苷酸差异数为4.796。D-loop序列共检测到200个多态位点,61种单倍型,单倍型多样性指数为0.922,核苷酸多样性指数为0.0157,平均核苷酸差异数为6.834。3个线粒体片段对于不同群体的遗传多样性检测结果显示,D-loop和COⅠ序列的多态位点数、单倍型数和核苷酸多样性均显著高于16S rDNA序列,更适用于同一物种不同群体遗传结构的解析。韩国浦项地区3个群体遗传多样性最高,这可能与其所处地理位置洋流影响有关。利用COⅠ基因对采自浦项的3种体色刺参进行遗传分化分析,遗传分化系数Fst<0.05,不存在遗传分化。对所采集的群体构建的系统进化树结果显示,青岛海参群体与烟台海参群体聚为一支,再与韩国群山黑参群体聚为一支,然后与韩国木浦黑参群体聚在一起,向外依次为俄罗斯群体及韩国浦项的3个群体,不同种群的遗传结构受洋流影响最大,其次跟其地理分布有关。     

刺参养殖池塘中一株植物乳杆菌的分离及其生物学特性

2017年5月,从山东东营刺参(Apostichopus japonicus)养殖池塘底泥中分离获得49株乳酸菌。以刺参“腐皮综合征”的2株致病菌[灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)]为指示菌进行拮抗作用实验,获得1株具有显著抑菌活性的乳酸菌CLY-5,对该菌株进行了生理生化实验、16S rDNA序列分析、生长特性及其对刺参的安全性研究。结果显示,菌株CLY-5对灿烂弧菌和假交替单胞菌具有较好的抑制作用,且菌株的胞内产物与胞外产物均具有抑菌效果,抑菌圈分别为20 、23 mm和27 、38 mm,胞外产物的拮抗作用优于胞内产物。利用该菌对刺参进行高浓度浸浴测试其安全性,浓度为1×109、1×108和1×107 CFU/ml,实验期间刺参状态良好,无死亡现象。16S rDNA序列分析表明,CLY-5与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum NR117813.1)的相似性为100%,初步鉴定该菌株为植物乳杆菌。菌株CLY-5在30℃~44℃、pH 6~8范围内生长较快,20 h进入对数生长期,28~32 h达到生长高峰。筛选的植物乳杆菌具有良好的抑菌能力,且其生长特性适应刺参池塘的养殖环境,为刺参疾病的生态防控及乳酸菌资源的开发提供应用数据参考。     

5种海藻在刺参幼参饲料中的应用研究

本研究通过分析刺参(Apostichopus japonicus)幼参[(10.02±0.03) g]生长性能、体组成、肠道消化酶活性及非特异性免疫性能的变化,评价鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、铜藻(Sargassaum horneri)、海带(Saccharina japonica)、海带渣、石莼(Ulva lactuca L.)及混合藻粉在刺参幼参养殖中的应用效果,在室内循环水系统中进行了为期56 d的养殖实验。结果显示,1) 鼠尾藻和混合藻粉组刺参的增重率(WGR)和特定生长率(SGR)极显著高于其他各藻粉组(P<0.01),海带渣组刺参的WGR和SGR最低,肠体比(IBR)和脏体比(VBR)均显著低于其他各组(P<0.05),藻粉对刺参存活率(SR)影响不显著(P>0.05);2) 不同藻粉对刺参体壁水分、粗灰分、粗蛋白和粗脂肪影响不显著(P>0.05);3) 鼠尾藻和混合藻粉组肠道胰蛋白酶活性极显著高于海带、海带渣和石莼组,海带渣组最低(P<0.01);藻粉对α-淀粉酶和脂肪酶活性无显著影响(P>0.05),但对刺参粪便的酸不溶性灰分具有极显著影响(P<0.01);4) 鼠尾藻组和混合藻粉组刺参肠道超氧化物歧化酶(T-SOD)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性极显著高于其他各组(P<0.01),海带渣组丙二醛(MDA)含量极显著高于其他各组(P<0.01)。研究表明,在本实验条件下,综合考虑刺参的生长性能及非特异性免疫性能,添加任一海藻均未达到替代鼠尾藻的饲喂效果,但多种海藻混合添加,其生长性能及非特异性免疫性能与单独添加鼠尾藻效果一致。     

两种甘薯饲料原料的营养成分及其对仿刺参(Apostichopus japonicus)摄食与生长的影响

在刺参配合饲料中添加6个比例(10％、20％、30％、40％、50％、60％)的甘薯块根粉与甘薯蔓茎粉,测定两种甘薯饲料原料的营养成分及其对仿刺参摄食与生长的影响.结果显示,甘薯块根粉中粗蛋白含量为10.01％,甘薯蔓茎粉中粗蛋白含量为5.54％;每100 g甘薯块根与蔓茎粉中氨基酸总量分别为7.33 g和4.37 g.在30 d的实验期间,投喂添加甘薯块根粉饲料的实验组仿刺参平均体重随实验时间呈上升趋势,实验结束时,10％和20％组特定生长率(SGR)显著高于对照组(P＜0.05), 30％组SGR与对照组差异不显著(P＞0.05).投喂添加10％甘薯蔓茎粉的实验组仿刺参SGR与对照组差异不显著(P＞0.05),其余各组SGR均低于对照组(P＜0.05).投喂添加10％、20％甘薯块根粉饲料的实验组仿刺参食物转化率(FCE)显著高于对照组(P＜0.05),投喂添加10％甘薯蔓茎粉饲料的实验组FCE与对照组差异不显著(P＞0.05),其余各实验组仿刺参FCE显著低于对照组(P＜0.05).结果表明,当甘薯块根粉和甘薯蔓茎粉添加比例分别低于30％和10％时,可满足刺参的营养需求,提高饲料利用效率,保证并促进仿刺参的摄食与生长.     

刺参池塘综合养殖技术

进行刺参单品种养殖的池塘,产出单一,抵御各种风险的能力和经济效益低下,若有操作不当或受其它外界因素影响,极易全军覆没,血本无归。养殖刺参的池塘进行综合养殖,能够充分利用水域空间和池塘滩面,多个品种同时进行养殖,各养殖品种之间互利共生,形成一种稳定的生态系统,减少病害,促进生长,增加产出,使池塘养殖抵御风险的能力和养殖效益明显提高。     

应用稳定同位素分析辽东湾池塘仿刺参的食性

为分析辽东湾海水生态养殖池塘仿刺参的食性特征,分别于2016年3月、5月、7月、9月、12月采集池塘中的浮游植物、浮游动物、颗粒有机物、底栖硅藻、表层底泥和仿刺参,并检测所有样品的δ¹³C和δ¹⁵N值。运用IsoSource线性混合模型计算出浮游植物、浮游动物、颗粒有机物、底栖硅藻、表层底泥对仿刺参的饵料贡献率。试验结果显示,底栖硅藻对仿刺参的平均饵料贡献率周年变化为78.5%～85.7%,颗粒有机物、浮游植物、浮游动物和表层底泥对仿刺参的贡献率分别为2.1%～5.1%、2.2%～5.6%、2.3%～7.7%、3.6%～7.9%。底栖硅藻对消化管内含物δ¹³C值的贡献率为25.8%～74.5%、颗粒有机物、浮游植物、浮游动物和表层底泥对消化管内含物δ¹³C值的贡献率分别为3.9%～15.3%、4.0%～18.3%、4.2%～19.4%、5.6%～22.2%。试验结果表明,在不投饵、缺乏底栖大型藻类的生态养殖池塘中,底栖硅藻是仿刺参主要的食物来源,仿刺参也摄食表层底泥、沉降后颗粒有机物和浮游动植物。研究结果可为海水池塘仿刺参的生态健康养殖提供基础数据。