造血器官坏死病病毒M蛋白的可溶性表达及免疫原性分析

为在大肠杆菌中高效表达出可溶性的传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）基质蛋白M，并分析其免疫原性，构建了pMAL-c2x-m原核表达质粒，优化表达条件并纯化MBP-M融合蛋白；对蛋白进行Western blot和DDA鉴定；将鉴定后的蛋白免疫BALB/c小鼠，利用Western blot鉴定鼠抗MBP-M血清，通过间接ELISA检测该血清效价。结果显示：在大肠杆菌中获得了可溶性的MBP-M蛋白，其相对分子质量约为64 kDa，与预期结果一致；MBP-M蛋白在IPTG为0.5 mmol/L,25℃诱导12 h时上清表达量较高；经Western blot鉴定，MBP-M蛋白可与鼠抗血清发生特异性反应，而不与阴性对照血清发生反应；ELISA检测血清效价达1:25 600。结果表明，本研究获得的MBP-M蛋白具有较好的免疫原性，这为IHNV基因工程疫苗研发奠定了基础。     

奶牛乳房炎主要病原菌GapC蛋白生物信息学分析及抗原表位预测

奶牛乳腺炎是主要由病原菌感染引起的奶牛常见疾病，新型疫苗研发是防控奶牛乳腺炎的重要内容之一。引起奶牛乳腺炎的主要病原菌为链球菌和葡萄球菌，包括无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，它们都存在甘油醛-3-磷酸脱氢酶C(GapC)，且均能诱导机体产生良好的抗感染免疫保护作用。但对链球菌和葡萄球菌GapC的交叉免疫原性分析和研究缺乏报道。研究从GenBank获取链球菌和葡萄球菌GapC基因序列，利用生物信息学软件对理化性质、同源性、T细胞和B细胞表位等进行分析。结果显示，这些病原菌GapC均由336个氨基酸组成的亲水性蛋白，且无规则卷曲占比较高，表明具有良好的抗原性；三种链球菌与两种葡萄球菌之间GapC的氨基酸序列同源性67.8%～69.9%，存在4个共同线性B细胞表位、9个共同CD4⁺T细胞表位和9个共同CD8⁺T细胞表位，表明有一定的交叉免疫原性，为进一步实验研究GapC交叉免疫原性提供重要参考。     

绵羊肺炎支原体内蒙古分离株DnaJ基因克隆表达及其免疫原性研究

[目的] 克隆表达绵羊肺炎支原体DnaJ基因,研究其表达产物的免疫原性。[方法] 以绵羊肺炎支原体内蒙古分离株NM03-MO株基因组DNA为模板,克隆其DnaJ基因序列,对蛋白质序列进行分析比对及三维结构预测;将该基因片段连接至pColdⅠ表达载体,构建pColdⅠ-DnaJ原核表达载体表达重组DnaJ蛋白并纯化,通过Western blot技术检测其与支原体抗体阳性血清的结合活性。[结果] NM03-MO株DnaJ蛋白序列与绵羊肺炎支原体序列同源性最高,但三维结构存在一定差异,重组DnaJ蛋白与绵羊肺炎支原体阳性血清有较好的结合活性,初步证明该蛋白具有免疫原性。[结论] 绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白被首次成功克隆表达,且具有较好的免疫原性,为后续分子致病机制研究及新型疫苗研制奠定基础。     

羊口疮病毒B2L和F1L截短融合基因原核表达产物的免疫原性分析

为分析羊口疮病毒(OrfV) B2L和F1L截短融合基因表达蛋白的反应原性，本研究分别选取B2L、F1L基因序列的主要抗原区域，采用重叠延伸PCR将二者融合后克隆至原核表达载体pET-32a中，构建重组质粒pET-32a-B2L-F1L，通过PCR、双酶切和测序鉴定，结果显示获得1 080 bp的B2L-F1L融合基因目的片段，测序结果经比对分析正确无误，表明正确构建了重组表达质粒pET-32a-B2L-F1L。将pET-32a-B2L-F1L转化BL21 (DE3)后经IPTG诱导，SDS-PAGE检测结果显示表达了39 ku的重组蛋白rB2L-F1L。采用Ni-IDA亲和层析方法纯化重组蛋白，经western blot鉴定，结果显示获得39 ku的单一特异性条带，表明rB2L-F1L的纯化效果和免疫原性均较好。采用rB2L-F1L纯化蛋白皮下多点注射免疫羔羊，采用ELISA方法检测免疫后不同时间羔羊血清中的OrfV抗体、IL-2、IFN-γ和IL-4细胞因子。结果显示，与生理盐水组相比，rB2L-F1L能够诱导羔羊产生OrfV特异性抗体，并可显著或极显著诱导羔羊分泌IL-2、IFN...     

布氏杆菌单克隆抗独特型抗体细胞株建立及免疫原性测定

在建立了布氏杆菌单克隆抗体细胞株的基础上,筛选具有强保护作用的单抗细胞株A7免疫BALB/C鼠,并进行细胞融合.用竞争抑制ELISA法筛选出5个强阳性孔,经克隆化培养后首次建立了9个布氏杆菌单克隆抗独特型抗体细胞株.其中,F9株传25代后及液氮冻存复苏后仍能稳定地产生高效价的抗独特型抗体.其IgG类型鉴定为IgG2a,并证实具有抗原“内影象”.以鼠红细胞为载体将抗独特型抗体吸附其表面进行小鼠免疫试验,检测结果表明该抗独特型抗体具有良好的免疫原性,能诱导免疫小鼠产生相当效价抗布氏杆菌抗体(Ab3).     

胸膜肺炎放线杆菌RTX毒素抗原优势决定簇的筛选和融合表达

为了制备胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)亚单位疫苗和建立配套的诊断方法，本研究在对APP的RTX毒素(ApxⅠ～Ⅲ)生物学信息分析的基础上，以APP血清5型和8型的DNA为模板对ApxⅠ～Ⅲ分段扩增后进行截短表达，获得12个截短表达蛋白。利用Western blot对12个表达蛋白进行抗原性分析，确定ApxⅠ～Ⅲ的优势抗原决定簇分别为蛋白AⅠ2、AⅡ3和AⅢ2。以蛋白AⅡ3、AⅢ2、AⅠ2的顺序排列并在蛋白间加入GPGPG氨基酸序列，无缝克隆3个蛋白片段基因，通过原核表达获得融合蛋白A231。该蛋白可与临床APP阳性猪血清特异性结合，具有良好的免疫反应性。该研究的成功开展可为研制具有交叉保护力的亚单位疫苗及建立配套ELISA检测方法奠定基础。     

巨型艾美耳球虫山西早熟株诱导及生物学特性研究

本研究采用早熟选育技术，诱导选育出1株与已获得的山东株免疫原性差异较大的巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)山西株的早熟弱毒株，并对其进行生物学特性研究。结果表明：早熟诱导获得的巨型艾美耳球虫山西早熟株卵囊略小于亲本株，潜隐期为109 h;早熟株各组小肠病变记分差异显著低于(P<0.05)亲本株组，且临床症状较亲本株组弱；等剂量下，早熟株组的卵囊产量及卵囊繁殖力低于亲本株组；早熟株单次免疫剂量≥400个卵囊/只、2次免疫的一免剂量≥100个卵囊/只、二免剂量≥200个卵囊/只时可达到良好免疫效果。本研究结果为制备高效广谱、免疫原性良好的鸡球虫疫苗提供虫株和理论依据。     

鸡传染性鼻炎三价灭活疫苗生产用菌株的筛选

为了筛选免疫原性良好的鸡传染性鼻炎灭活疫苗生产用菌株，本试验对分离的5株A型、3株B型和3株C型副鸡禽杆菌的致病性和免疫原性进行分析。首先通过毒力试验筛选毒力较强的菌株，对筛选出的菌株进行最小发病剂量测定，再将最小发病剂量定为攻毒剂量，进行免疫原性分析和最小抗原含量测定。毒力试验结果显示，11株分离株均具有较强的毒力，从中筛选出毒力较强的A型菌2株(HN3株和HB2株)、B型菌2株(HN5株和SD4株)和C型菌2株(HN1株和SD3株)。最小发病剂量测定结果显示，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株毒力最强，最小发病剂量分别约为2.0×10⁴、1.8×10³和2.3×10³CFU。免疫原性分析和最小抗原含量测定结果显示，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株具有良好的免疫原性，不仅可以抵抗同源菌株的攻击，还能对同血清型异源菌株提供良好的保护，免疫后血清HI抗体效价和阳性比例均较高，且与攻毒保护相关性较好，A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株的最小抗原含量分别为5.0×10⁸、1.0×10<...     

绵羊肺炎支原体P110/LppT黏附素家族保守区的原核表达和免疫原性分析

绵羊肺炎支原体(Mo) NM2010株的P120蛋白与猪肺炎支原体(Mhp)的黏附素P110高度同源，同属于P110/LppT黏附素N端结构域家族。为了筛选用于研制广谱绵羊支原体肺炎疫苗的保护性抗原，本试验利用生物信息学方法对Mo NM2010株P120蛋白的保守区段、结构、B细胞抗原表位进行预测分析，并对P120基因的N端和C端2个保守区基因片段进行克隆、表达、可溶性分析和抗原特性分析；2个表达产物分别对兔进行免疫试验，用ELISA方法检测免疫兔血清抗体效价和IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子浓度。结果显示，P120蛋白N端有信号肽和1个跨膜螺旋，亚细胞定位在外膜，可能是一种外膜蛋白，P120蛋白N端和C端2个保守区段均有较多B细胞线性抗原表位，具有较好的抗原性；经序列测定证实，合成的P120-N和P120-C 2个基因片段的基因序列完全正确，长度分别为1 509 bp和741 bp,表达的重组蛋白分子质量分别为58.1 kDa和29.5 kDa; P120蛋白N端以可溶和包涵体2种形式存在，C端以包涵体形式存在，均具有良好的抗原性；新西兰大白兔经4次免疫后，重组蛋白...     

牛源犬新孢子虫NcGRA9基因原核表达及免疫原性分析

为了确定牛源犬新孢子虫NcGRA9基因的功能及表达蛋白的免疫原性，本试验PCR扩增牛源犬新孢子虫NcGRA9基因，构建克隆质粒pMD18-T-NcGRA9和原核表达质粒pGEX-4T-NcGRA9,转化大肠杆菌BL21感受态细胞中IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western blot分析表达重组蛋白的反应原性，应用重组蛋白与弗氏佐剂混合接种BALB/c小鼠，ELISA检测小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平。结果显示，经PCR扩增获得522 bp的NcGRA9片段，表达蛋白纯化后相对分子质量约为45 kDa,具有良好的反应原性；重组蛋白接种BALB/c小鼠后，免疫组小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体水平以及IFN-γ、IL-4细胞因子水平均极显著高于PBS对照组(P<0.01),说明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验表达的NcGRA9重组蛋白具有良好的抗原性，为新孢子虫病的防控奠定了基础。