扩增片段长度多态性（AFLP）在动物遗传育种中的应用进展

AFLP是一种新的分子遗传标记技术，它结合了RFLP和PCR技术的优点，具有RFLP的稳定性和PCR的高效性，被称为“最有威力的分子遗传标记”或“下一代分子标记”。相对于国外而言，我国在这方面的研究还比较少。本文综述了扩增片段长度多态性(AFLP)这种遗传标记的原理、技术特点、技术发展及其在动物遗传多样性、种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位和标记辅助育种等研究中的应用。     

鼠层粘蛋白α5链E3、LG4、LG5片段的克隆及表达

从鼠的肝脏组织中提取总 RNA,采用 RT- PCR获得了鼠层粘蛋白 ( laminin)α5链的 E3 ( L G4 - 5)、L G4 和 L G5等 3个基因片段 ,与 NCBI数据库参考序列相比 ,同源性在 99%以上。将 E3 ( L G4 ,5)、L G4 和 L G5定向克隆到原核高效表达载体 Pet- 2 8a中 ,构建 Pet- 2 8a- E3 、Pet- 2 8a- L G4 、Pet- 2 8a- L G5等 3个原核表达质粒。将表达质粒转化表达受体菌 BL2 1中 ,IPTG诱导表达。收集菌液进行 SDS- PAGE电泳、Western- blotting分析 ,结果显示 ,这 3段基因在原核细胞中成功表达 ,薄层扫描显示表达蛋白占细胞总蛋白的 2 0 %以上。大量提取包涵体 ,纯化后免疫家兔 ,8周后得多克隆抗体 ,间接 EL ISA在抗体稀释到 1∶ 1 2 80 0时仍为阳性     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区原核表达载体的构建及表达

用RT-PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株(Shimen)、近期地方流行的属于第1群毒株的新疆毒株(XJ)和第2群代表毒株甘肃临洮(LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增，均得到约561bp的基因片段；经克隆测序及序列分析，该基因编码187个氨基酸残基，预计蛋白分子质量为21.7ku。将这4个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，阅读框是正确的，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，对表达的蛋白用SDSPAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明，E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达，表达的蛋白多以包涵体形式存在，表达产物的分子质量约为50．0ku，与理论推测的分子质量一致；薄层凝胶扫描分析表明。表达蛋白约占菌体蛋白总量的20．1％；免疫印迹结果证明，表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。     

羊草叶绿体非编码区多态性标记筛选及群体遗传多样性

为筛选多态性丰富的羊草叶绿体非编码区片段,本研究以9个不同地理位置的羊草居群为材料,通过对12个叶绿体非编码区DNA片段测序及其序列间变异分析试图从中找出有遗传差异的叶绿体DNA(cpDNA)片段,并利用有多态性的cpDNA片段进行遗传多样性分析。结果表明,序列ndhF-rpl32、trnL-trnF、trnC-ycf6、aptI-aptH具有比较丰富的变异,可作为下一步研究野生羊草群体遗传学和谱系地理学较为理想的分子标记。在37个羊草个体4条非编码区片段的合并序列中,共检测到15种单倍型,单倍型多态性(Hd)为0.928,核苷酸多态性(Pi)为0.00101;遗传分化指数(Fst)为0.58884,基因流(Nm)为0.17,基因流较小;中性检验Tajima’s D(-1.08542)和Fu’s Fs(-5.301)均为负值,且差异不显著(P>0.10),推测羊草遵循中性进化理论,可能经历过种群扩张;AMOVA结果显示,65%的分子变异出现在居群间,35%出现在居群内;Mantel检验得到,遗传距离与地理距离具有显著相关性(r=0.449,P<0.05);居群分化值Nst 0.386(0.1865)大于Gst 0.234(0.1506),差异显著(P<0.05),表明羊草居群存在分子谱系地理结构。通过系统发育树分析得到,羊草15个单倍型分为两大分支,H2和H10聚为一支,它们与别的居群个体亲缘关系较远,其余单倍型聚为另一支;单倍型网络图显示,H2和H12、H10和H12亲缘关系较远,与系统发育树分析结果基本一致。本研究为羊草的种质资源保护、谱系地理学研究等工作奠定了基础。     

桃若干重要特异性状的遗传趋向分析

为了明确桃树菊花花形、窄叶形、白化与黄化叶色及盘龙形与垂枝形树形等6个性状的遗传特性,以‘粉菊花桃’ב红根甘肃桃1号’、‘红花重瓣垂枝桃’(简称‘红垂枝’)ב粉菊花桃’、‘S9’ב粉菊花桃’、‘粉菊花桃’ב瑞光2号’、‘红珊瑚’×(‘粉菊花桃’ב瑞光2号’)为组合配制F_1和F_2代,研究菊花花形、叶片白化及垂枝树形的遗传特性;以‘98-4-32’ב金蜜狭叶桃’、‘99-7-14’ב金蜜狭叶桃’及‘99-7-15’ב金蜜狭叶桃’为组合配制F_1和F_2代,研究窄叶形遗传趋向;以‘北京2-7’ב白花山碧桃’为组合配制F_1和F_2代,研究叶片黄化遗传特点;以‘红垂枝’ב帚形山桃’及‘96-7-56’ב帚形山桃’为组合配制F_1和F_2代,研究盘龙形树形的遗传。结果表明:在蔷薇花形与菊花花形组合中,"蔷薇形/菊花形"表现出2对等位基因(Ch/ch及Ch_2/ch_2)控制的遗传特性,且蔷薇形对菊花形为显性;在铃形花形与菊花花形组合中,F_1代蔷薇形表现为二者的中间类型。在‘98-4-32’ב金蜜狭叶桃’及‘99-7-14’ב金蜜狭叶桃’组合中,"宽叶/窄叶"表现出2对等位基因(Nl/nl及Nl_2/nl_2)控制的遗传特性,且宽叶对窄叶为显性;在‘99-7-15’ב金蜜狭叶桃’组合中,"宽叶/窄叶"表现出1对等位基因控制的遗传特性。叶片"正常/白化"表现出1对等位基因(Wl/wl)控制的遗传特性,且正常对白化为显性,白化基因可能来自‘粉菊花桃’;叶片"正常/黄化"表现出2对等位基因(Yl/yl及Yl_2/yl_2)控制的遗传特性,其中1对为显性时对另一对具有抑制作用,黄化基因可能来自‘白花山碧桃’。直立树形同时表现为盘龙形与垂枝形及盘龙形与开张形的中间类型;"开张形/垂枝形"表现出1对等位基因(We/we)控制的遗传特性,且开张对垂枝为显性。结论:菊花花形由2对隐性基因(chchch_2ch_2)控制;窄叶形可能由2对隐性基因(nlnlnl_2nl_2)控制;叶片白化由1对隐性基因(wlwl)控制;叶片黄化可能由2对等位基因(Yl_yl_2yl_2或Yl_2_ylyl)控制;仅盘龙形与直立形由1对等位基因(Br_2/br_2)控制,其中盘龙形基因型为br_2br_2;垂枝形由1对隐性基因(wewe)控制。     

花生种子特异启动子AHSSP1的克隆及功能分析

为丰富花生种子特异启动子资源,本研究利用PCR技术在花生基因组中克隆了种子贮藏蛋白基因PSC32的启动子AHSSP1,利用半定量RT-PCR检测了PSC32基因表达模式,借助NewPLACE在线分析了AHSSP1序列中存在的顺式作用元件,并构建了AHSSP1驱动GUS报告基因的表达载体,经农杆菌转化获得转基因拟南芥,经GUS组织化学染色鉴定了该启动子的功能。结果表明,PSC32基因957 bp长的启动子AHSSP1序列具备种子特异表达启动子特有的3个RY REPEAT元件。半定量RT-PCR分析发现,PSC32基因在花生成熟种子中表达,而在饱果成熟期根、茎、叶片、花、入土前的果针、成熟种子的果壳中均不表达。GUS组织化学染色发现,转基因拟南芥成熟种子以及萌发种子的子叶、下胚轴和胚根均能够被染上蓝色;长出真叶后,子叶和下胚轴仍能被染色,而根和真叶不能被染上蓝色;成年期转基因拟南芥的叶片也不能被染上蓝色。而野生型拟南芥整个生长时期均不能被染上蓝色。以上现象说明AHSSP1是一个种子特异启动子。本研究丰富了花生种子特异启动子的资源,对花生籽仁品质改良或以花生籽仁作为“生物反应器”的研究具有重要的应用价值。     

三种去除非全长 cDNA 片段方法的比较研究

以小桐子的雌花为材料，用胶回收法、CHROMA －SPIN 400柱离心法和CHROMA －SPIN 400柱自流法分别去除全长cDNA文库构建中非全长cDNA小片段，从去除效果、回收率、成本、实验时长、一次处理量这5个方面对3种方法进行了综合比较与评价。结果表明：CHROMA －SPIN 400柱自流法在回收率方面有明显优势；胶回收法与 CHROMA －SPIN 400柱离心法的回收率接近，但胶回收法成本低于CHROMA －SPIN 400柱法，且对非全长片段去除更彻底。反倒是最新的CHROMA －SPIN 400柱离心法在关键方面都不及另两种方法，不提倡使用，结论为胶回收法是去除全长cD N A溶液中非全长片段的理想方法。     

改进型胶原诱导的小鼠关节炎动物模型的建立

为了克服胶原诱导的关节炎(CIA)模型的诸如造模时间长,发病率偏低,发病严重程度较低,动物个体间疾病严重程度差异大等缺点,本试验探索采用抗Ⅱ型胶原(CII)/CD3双特异抗体联合胶原免疫来建立一个改进型CIA模型。本试验首先通过化学连接方法制备了抗CII/CD3双特异抗体。体外研究发现,该双特异抗体较好地保持了与CII以及小鼠CD3分子的结合能力,并且能同时有效地结合CII和CD3分子。体内试验发现,在胶原诱导的基础上给予抗CII/CD3双特异抗体,早在胶原免疫后25 d左右小鼠即开始发病,发病率高达100%,关节炎指数评分可以达到并稳定在10分左右的水平,并且个体间炎症严重程度差异较小。该改进型模型相对于常规CIA模型具有明显优势。该模型的成功建立,为深入揭示类风湿关节炎的发病机制、筛选和评价类风湿关节炎治疗药物,提供了更适宜的动物模型。     

水稻复合农艺性状QTL剖析

为了解水稻复合性状的数量性状基因座(QTL),在利用单片段代换系进行QTL鉴定的基础上,剖析了水稻株高QTL与主茎高和穗长QTL,主茎高与倒一节间长、倒二节间长、倒三节间长和倒四及以下节间长QTL,谷粒长宽比QTL与粒长和粒宽QTL,每穗粒数QTL与一次枝梗数和二次枝梗数QTL的关系。结果表明:鉴定出株高QTL的6个单片段代换系中有4个只检测出了主茎高QTL,其加性效应百分率为86.00%～99.55%,有1个只检测出了穗长QTL,其加性效应百分率为48.31%,有1个同时检测出了主茎高QTL和穗长QTL,其中主茎高QTL的加性效应百分率为81.72%,穗长QTL加性效应百分率为18.28%;在检测出主茎高QTL的7个单片段代换系中,有1个只检测出倒一节间长QTL,有2个只检测出倒二节间长QTL,有2个检测出倒一节间长QTL和倒二节间长QTL,有2个只检测出倒三节间长QTL;不同的单片段代换系中检测出的节间长的QTL加性效应百分率变化范围为-128.62%～172.07%;7个检测出谷粒长宽比QTL的单片段代换系中,有5个只检测出粒长QTL,1个只检测出粒宽QTL,1个同时检测出了粒长QTL和粒宽QTL;检测出每穗粒数QTL的3个单片段代换系中,有2个只检测出二次枝梗数的QTL,有1个同时检测出一次枝梗数QTL和二次枝梗数的QTL。这些结果表明,代换片段中如能检出复合性状QTL,也可以检出其构成性状QTL;复合性状QTL的加性效应的大部分可由其构成性状QTL的综合效应来解析,但相同的复合性状,不同代换片段检出的构成性状QTL不同。