猪细环病毒2型荧光定量PCR检测方法的优化

[目的]优化1种猪细环病毒2型(TTSuV2)的荧光定量PCR检测方法.[方法]对原有引物进行调整设计,以原有重组质粒为模板来重新进行检测TTSuV2 DNA的SYBR Green Ⅰ real-time PCR扩增.[结果]新的TTSuV2 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为99.3％,标准曲线的决定系数为0.998,可准确检测的最低核酸模板浓度为50 copies/μL.与原方法相比较,新方法在熔解曲线、特异性、重复性方面都非常接近,但在扩增曲线方面得到明显改善,其可准确定量检测的灵敏度提高了至少10倍以上,临床检测数据也更加准确可靠.[结论]建立了一种新的准确灵敏度更高的定量检测TTSuV2的荧光定量PCR方法.     

基于线粒体COⅠ基因序列的三疣梭子蟹东海区群体遗传多样性分析

通过对分布在东海区远海区(济州岛海域)和近海区(长江口以南和以北海域)的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)自然群体线粒体COⅠ基因部分序列的测定,比较并分析了其群体遗传多样性和遗传结构。在24个采集点共286个样本的线粒体COⅠ序列中共检测到45种单倍型,单倍型多样性为0.864;核苷酸多样性为0.002 84,平均核苷酸变异数是1.686,其中有23个单倍型为单个采集点所独享,Hap3出现频率最高,在23个采样点的83个样本中均有发现,是所有三疣梭子蟹样本的共享中心单倍型。群体遗传多样性分析显示,远海区群体的遗传多样性水平最高,其次为长江口以北群体,长江口以南群体最低。由群体间遗传距离、系统进化树和单倍型网络关系图发现,东海区海域三疣梭子蟹种群间存在基因交流,亲缘关系的远近不以地理位置的远近为依据;AMOVA分子方差分析结果显示,三疣梭子蟹的遗传变异主要来自群体内,而群体间无显著遗传分化,不存在明显的地理趋势。     

鲤IGF-Ⅰ基因2个高度多态微卫星位点的鉴定及其与生长相关性状的关联分析

利用PCR结合测序方法,在鲤(Cyprinus carpio)类胰岛素生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)基因内含子1和内含子2中各鉴定1个微卫星多态性位点,分别命名为intron1189和intron2310,这两个位点均以4碱基为重复单元.以黑龙江鲤(Cyprinus cario haematopterus,YL)(n=263)、德国镜鲤选育系(Cyprinus carpio L.mirror,JL)(n=229),及荷包红鲤抗寒品系(Cyprinus carpio var.wuyuanensis,HL)(n=255)为研究对象,评估了这两个位点不同基因型(频率＞3％)与鲤4个生长时段(135 d、325 d、335 d和445 d)生长表型的关联.结果显示,2个位点在3个鲤群体中均表现为高度多态(PIC＞0.5).intron1189位点多态性主要对YL的135 d、325 d体长和325 d、385 d体质量有显著影响(P＜0.05),而intron2 310位点多态性对JL各检测时段的体长和体质量均有显著影响(P＜0.05).对不同基因型个体的体长和体质量性状进行多重比较,结果显示,在intron 1189位点,185/229基因型YL的135 d、325 d体长和325 d、385 d体质量最低,而205/221基因型YL的135 d、325 d体长和325 d体质量最高.在mtron2310位点,290/350基因型JL在各检测时段的体长及135 d、325 d、385 d体质量最低,而318/350基因型JL的135 d、325 d、385 d体长和体质量均为最高.上述结果表明,鲤IGF-Ⅰ基因内含子中的这两个高度多态微卫星位点潜在影响鲤的生长性能.     

橘小实蝇不育雄虫与野生雄虫间遗传分化

对橘小实蝇不育雄虫和福建7个不同地区的野生雄虫共37个个体的线粒体细胞色素氧化酶I（mtDNA COI）基因进行了部分序列测定。在获得的650bp序列中,共有72个变异位点、32个单倍型,其中共享单倍型3种;对所有单倍型聚类分析发现,单倍型在系统树中的分布散乱,没有显示出明显的地理分布族群;结合遗传变异指数（Fst）和净遗传距离（Da）分析认为橘小实蝇不育雄虫与野生虫源间、不同来源的野生虫源间已存有一定程度的遗传分化,但分化程度较低。研究认为应用昆虫不育技术防治橘小实蝇,在饲养过程中需针对不同防治区引进野生虫源复壮,以确保不育雄虫和野生虫源相匹配,提高防治效果。     

三种猪Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的三种猪Ⅰ型干扰素（porcine interferon,pIFN）基因序列,设计了3对特异性引物。运用RT—PCR技术从长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到了三种猪干扰素基因,并将其克隆至pGEM-T Easy载体上。序列测定结果显示,获得的猪干扰素α1基因序列全长570bp,编码189个氨基酸,获得的猪干扰素α2基因序列全长540bp,编码179个氨基酸,获得的猪干扰素β基因序列全长563bp,编码186个氨基酸。三种猪Ⅰ型干扰素基因与已知猪Ⅰ型干扰素核苷酸序列和氨基酸序列的相似性最高可达99％～100％。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ模式实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank猪细小病毒(PPV)的NS1基因序列,设计一对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立实时定量PCR检测方法,构建了检测PPV的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准质粒DNA模板在7.8×101～7.8×108拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997。该方法用于猪细小病毒的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪细小病毒的快速检测。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白ⅠcDNA的克隆及在原核细胞中的表达

 【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾（Spodoptera litura）GOBPⅠ（SlGOBPⅠ）的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在 pET-32a/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列（GenBank登录号为EU086372）,序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495 bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3 kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有 6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32 a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0 kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5 000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA 序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离与鉴定

鸭病毒性肝炎(duck virus hepatitis,DVH)是造成养鸭业严重经济损失的传染病之一。作者对松原市某鸭场送检的病死鸭进行病毒分离试验、雏鸭回归试验、DHV分离株ELD₅₀测定、雏鸭保护试验、鸡胚中和试验、鸭胚接种试验和电镜观察等,确诊该病为Ⅰ型鸭病毒性肝炎。试验所分离得到的Ⅰ型鸭肝炎病毒与标准毒株的回归试验病理特征存在一定差异,其基因序列的测定及分析还有待于进一步研究。     

撒坝猪胰岛素样生长因子-Ⅰ基因多态性及其与部分生长性状的关联分析

胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)基因的表达产物对猪肌肉的生长有着重要的调控作用。以IGF-Ⅰ基因作为撒坝猪生长性状的候选基因,运用PCR-RFLP技术对其HhaⅠ位点的多态性进行了检测,并对IGF-Ⅰ基因的多态性与12个阶段体重、日增重和体尺性状的关系进行了分析。结果表明,撒坝猪IGF-Ⅰ基因的多态性较为丰富,产生AA、AB和BB 3种基因型,其基因型频率分别是0.3473、0.5149、0.1378,等位基因A和B的频率分别是0.6048、0.3952,且该基因座位处于Hardy-Weinberg平衡状态,撒坝猪IGF-Ⅰ基因的遗传变异对其生长性状有着显著的影响(P<0.05或P<0.01),其中,不同阶段体重和日增重的增效基因型为AB基因型,180日龄体尺性状的增效基因型多为BB基因型(部分性状表现为AB基因型最高)。结合前人的研究,初步推断IGF-Ⅰ基因可能是影响猪生长性状的一个主效基因或是一个与影响猪生长性状的数量性状座位(quantiative trait locus, QTL)连锁的基因。     

胰岛素样生长因子Ⅰ基因第1内含子微卫星多态性对山西白猪体重和体尺性状的影响

试验检测了山西白猪174个个体胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor Ⅰ,IGF-Ⅰ)基因第1内含子以CA为核心重复序列的微卫星座位的多态性,并利用单变量动物模型分析了多态位点对山西白猪不同阶段体重和体尺性状的影响。结果表明,在该座位上,共检测到6个等位基因,分别为198、202、204、206、208和210 bp,表现出CA重复数较低的等位基因198和202 bp频率较高,分别为0.2759和0.2385;CA重复数较高的等位基因208 bp频率较低,为0.0747;共检测到12种基因型,纯合子频率较高,均大于0.010(208/208 bp类型除外);而杂合子个体频率都较低,为0.017。统计分析结果表明,IGF-Ⅰ基因型对山西白猪群体的初生重、断奶重、6月龄体重和体高、体长、胸围、背膘厚等性状有显著影响(P＜0.05)。204/204 bp基因型个体不同生长阶段体重高于其他类型个体,而6月龄活体背膘厚又显著低于其他类型个体,符合中国当前猪育种方向,在选育中应优先选留。