玉米天冬氨酸蛋白酶基因家族的鉴定与表达分析

以玉米B73基因组为参考序列,在全基因组水平系统分析玉米天冬氨酸蛋白酶家族成员的基因组结构信息,深入了解玉米天冬氨酸蛋白酶家族基因(ZmAPs)的生物学功能。结果表明,总共鉴定出75个ZmAPs,通过系统进化树分析将ZmAPs分为两大亚组,同一亚组之间的motif分布与基因结构都相对保守。染色体定位和共线性分析发现,ZmAPs不均匀地分布在玉米的10条染色体上,其中,7对为串联重复基因。对其启动子顺式作用元件分析后发现,ZmAPs可能参与光响应、MeJA及ABA等信号通路。对生物与非生物胁迫下的玉米转录组表达谱分析发现,ZmAPs对生物胁迫的响应更为强烈,表明ZmAPs可能参与玉米抗病的过程。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2的克隆及其功能分析

【目的】 克隆鉴定褐飞虱（Nilaparvata lugens）丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2,探明其表达模式和生物学功能。【方法】 基于褐飞虱转录组数据,利用PCR技术克隆Nlserpin2全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核酸和蛋白序列特征;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测其在褐飞虱不同发育时期（卵、1—5龄若虫和雌雄成虫）和初羽化雌成虫不同组织（脂肪体、肠道和卵巢）中的表达,以及病原真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）侵染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式;利用RNAi技术探明Nlserpin2基因沉默对褐飞虱5龄若虫存活率及抵御金龟子绿僵菌侵染能力的影响。【结果】 Nlserpin2 cDNA序列（GenBank登录号：KC355239）全长1 209 bp,编码402个氨基酸,含有serpin蛋白超家族所具有的典型serpin结构域和RCL区,且N端包含一段由27个氨基酸残基组成的信号肽。系统进化树分析表明,Nlserpin2与半翅目其他昆虫的serpin聚为一支,其中与白背飞虱（Sogatella furcifera）serpin亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin2表达具有明显的时空特异性,其在褐飞虱成虫中的表达量显著高于其他龄期,且在雄成虫中表达量最高;卵和低龄若虫（1—3龄）中Nlserpin2的表达量显著低于高龄若虫（4—5龄）,其中3龄若虫期最低;Nlserpin2在褐飞虱雌成虫肠道、脂肪体和卵巢中均有表达,且肠道中表达量显著高于脂肪体和卵巢。金龟子绿僵菌诱导2 d和3 d后Nlserpin2的表达量显著上调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin2表达量呈回稳趋势。RNAi分析结果显示,显微注射dsNlserpin2可显著抑制Nlserpin2的表达水平。干扰Nlserpin2后褐飞虱5龄若虫的存活率以及对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力均显著降低。与对照组相比,Nlserpin2干扰的褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染5 d和8 d后的校正存活率分别下降了28.4%和31.0%,且均达到显著水平。【结论】 Nlserpin2在褐飞虱防御病原真菌侵染过程中发挥重要作用,可作为应用RNAi技术防控褐飞虱的潜在靶标和褐飞虱高毒力病原真菌遗传改良的资源基因。     

尕海湿地不同退化梯度土壤脲酶与蛋白酶活性时空分布特征

为探讨高寒湿地退化对土壤酶活性的影响，本文以青藏高原东缘尕海湿地未退化、轻度退化、中度退化和重度退化4种不同退化梯度的0～10、10～20和20～40 cm层土壤为研究对象，研究不同退化梯度土壤脲酶与蛋白酶活性时空变化特征。结果表明：随退化梯度加剧，土壤含水量降低，温度升高；土壤脲酶活性在0～40 cm土层中表现为随退化加剧而逐渐降低，而蛋白酶活性趋势恰好相反；除重度退化外，其他退化梯度土壤两种酶活性均随土层加深而降低；0～40 cm土层中脲酶与蛋白酶活性分别在7、8月和6、7月最高；相关性分析表明土壤脲酶活性与蛋白酶活性和温度极显著正相关(P<0.01)；土壤蛋白酶活性与微生物生物量氮极显著正相关(P<0.01)，与含水量和温度显著正相关(P<0.05)，与硝态氮显著负相关(P<0.05)。沼泽化草甸退化显著增加土壤表层脲酶活性而降低蛋白酶活性；温度对土壤脲酶与蛋白酶活性起促进作用，含水量、微生物生物量氮对土壤蛋白酶活性具有促进作用。     

荞麦蛋白的酶水解工艺条件研究

为确定木瓜蛋白酶水解荞麦蛋白的最佳工艺条件,以水解度(DH)为指标,系统分析了pH、温度、酶用量、时间、底物浓度等5个因素对木瓜蛋白酶水解荞麦蛋白的影响,并在此基础上进行了二次回归正交旋转试验(4因素全面试验),建立了木瓜蛋白酶水解荞麦蛋白的数学模型。结果表明,木瓜蛋白酶在底物浓度80 g/L、温度45℃、酶用量20 000 U/g、pH值7.0、反应时间为3 h时,荞麦蛋白的水解度可达14.38%。各因素对荞麦蛋白水解的影响顺序依次为:温度>pH值>酶用量>底物浓度。     

消减牛乳酪蛋白致敏性蛋白酶的筛选

以酪蛋白为研究对象，选取复合风味蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝 蛋白酶和中性蛋白酶共7 种食品级蛋白酶，对牛乳酪蛋白进行酶解。通过牛乳过敏患者血清池，评估酶解产物致敏 原性，同时结合水解产物的分子质量分布、水解度、残留表位信息等指标，筛选出最适合用于生产低致敏酪蛋白产 品的蛋白酶。结果表明：在相同条件下经胰凝乳蛋白酶、复合风味蛋白酶处理后酪蛋白与特异性抗体结合能力降低 程度最大，可用于后续低致敏酪蛋白制备的候选蛋白酶；结合T细胞表位预测结果，对酪蛋白水解产物进一步分析 发现，酪蛋白经过胰凝乳蛋白酶酶解后，仅剩余1 条大于9 个氨基酸的T细胞表位肽段LHSMKEGIHAQQK。     

产酸性蛋白酶深红沙雷氏菌的筛选及其在种子萌发中的应用

酸性蛋白酶在工业生产中需求量巨大，但我国产酸性蛋白酶菌株的品种较为单一，因此，亟需开发新型的微生物源蛋白酶和选育高产蛋白酶菌种。从海口红树林土壤中筛选出一株可以在酸性环境下产蛋白酶的菌株，采用福林酚法测定蛋白酶活，经过形态学观察、生理生化实验及16S rRNA序列比对鉴定为深红沙雷氏菌。利用该菌株发酵鱼下脚料制备生物液肥，通过种子萌发实验，研究发酵液的促生效果。结果显示，分离出的产酸性蛋白酶菌株R3可以用于鱼下脚料的发酵，在发酵液稀释5~25倍时，处理60 h均可以促进菜心种子的萌发，与市场购买的液肥效果相同。利用分离出的产酸性蛋白酶菌株发酵鱼下脚料制备生物液肥，实现了对废弃鱼蛋白资源的重新利用，增加了鱼类产品的附加值。     

芽孢杆菌蛋白酶基因的比较基因组学分析

【目的】研究芽孢杆菌产蛋白酶能力与携带的蛋白酶基因的关系，探寻影响芽孢杆菌产蛋白酶能 力的重要基因。【方法】通过 筛选培养基筛选能够产生蛋白酶的菌株，采用福林酚法 检测菌株产生的蛋白酶的活 性，对 15 株芽孢杆菌分离株进行全基因组测序，获得菌株染色体上携带的蛋白酶基因情况并将其分类；采用实 时荧光定量 PCR 方法检测蛋白酶基因 mRNA 的转录水平；通过比较基因组学和细菌全基因组关联分析（BGWAS）， 探讨影响细菌产蛋白酶能力高低的原因。【结果】根据菌株染色体上携带的蛋白酶基因情况，可分为 7 种基因 型（G1~G7）。比较基因组学和 BGWAS 分析发现，细菌染色体上携带的蛋白酶基因种类的多寡与其产蛋白酶能 力的高低有直接关系，且缺少 aprX 和 aprE 基因菌株的产蛋白酶能力明显下降。进一步研究基因 mRNA 水平发现， 芽孢杆菌产蛋白酶能力的差异与 aprX 的表达水平有关。【结论】 菌株染色体上携带的蛋白酶基因情况与菌株产 蛋白酶能力之间存在关联。aprX 是影响芽孢杆菌属细菌产胞外蛋白酶能力的重要基因。