IBDV地方变异株VP2基因的克隆与特性鉴定

应用 RT- PCR技术对 1株分离于地方免疫鸡群中暴发的传染性法氏囊病病例的传染性法氏囊病病毒 ( infec-tious bursal disease virus,IBDV) HN0 2 6株的 VP2基因进行了克隆与序列分析 ,并与相应毒株的 VP2高变区核苷酸及氨基酸序列进行了比较研究。结果表明 ,HN0 2 6株的核苷酸和氨基酸序列与变异株 Var- A的同源性最高 ,分别达97.3%和 97.6 % ;其次为超强毒株 UK6 6 1 ,分别为 95 .7%和 95 .2 % ;而和弱毒株 PBG98的同源率仅有 92 .8%和90 .3%。其中 ,在第一、二亲水区 ,HN0 2 6株均有 1个氨基酸发生了变化 ,即第 2 2 2位转变为 E、第 31 8位转变为 D。更重要的是 ,其 2 4 9位和 2 5 4位上的氨基酸分别为 K和 S,这些均为变异株的特性。另外 ,HN0 2 6株的七肽区保持SWSASGS不变 ,且第 2 79位和 2 84位氨基酸分别为 D和 A,又完全具备强毒株的特性。因此 ,初步确定所分离的HN0 2 6为有较强致病力的变异株 IBDV。     

2个旋毛虫新生幼虫期特异性相似cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA探针 ,从新生幼虫 c DNA文库中筛选出 2个相似的旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA克隆 ,分别命名为 N5和 N10 ,N5长度为 12 5 0 bp,N10长度为 12 33bp。 NCBI Blast检索表明 ,2个c DNA全长序列均为旋毛虫新基因序列。DNASIS分析表明 ,N5与 N10的开放阅读框架分别为 10 14、10 17bp,编码338、339个氨基酸 ,推导的成熟蛋白氨基酸序列均为 32 1个氨基酸残基 ,相对分子质量推导值分别为 35 30 0和 354 0 0。 2个氨基酸序列中 N端均包含有一信号肽序列 ,可能为分泌性蛋白。NCBI Blast及 Inter Proscan检索表明 ,以上2个氨基酸序列均含有 型核酸酶的功能结构域 ,均编码 型核酸酶 (DNase ) ,且与已报道的旋毛虫包囊形成相关蛋白 P4 3(经鉴定也为 DNase )同源性最高。目前已有的试验结果证实 ,P4 3并未直接参与包囊的形成 ,而是一种与P4 3蛋白同源性非常高的蛋白参与了旋毛虫包囊的形成。由于 N5与 N10为旋毛虫新生幼虫期特异性表达基因 ,也就是在旋毛虫包囊形成的时期表达 ,而且与 P4 3具有较高的同源性 ,并均编码 DNase 蛋白 ,因此 N5、N10具有参与旋毛虫包囊形成的潜在可能     

猫细小病毒NS部分基因的克隆及序列分析

将疫苗用猫细小病毒(FPV)株提取基因组DNA,针对NS特定片段设计引物,利用PCR扩增出了部分基因并将该基因克隆到pMD18-T Vector中测序.结果表明,该基因长613bp,编码204个氨基酸.分离株基因与犬的细小病毒(CPV)、貂的细小病毒(MEV)毒株核苷酸同源性均为99%.氨基酸同源性达到97%、98%以上,与犬、貂的肠炎病毒有密切的亲缘关系.     

土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因的克隆及其序列分析

目的利用RT-PCR和RACE技术克隆土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因全长序列并进行序列分析.方法根据日本血吸虫和曼氏血吸虫肌动蛋白基因的保守区设计引物,利用RT-PCR扩增出土耳其斯坦东毕吸虫的肌动蛋白基因的大片段,再结合RACE技术分别得到肌动蛋白的3＇端和5＇端,将三部分序列拼接后获得肌动蛋白基因的全长cDNA序列并进行序列分析.结果成功克隆了土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白的全长cDNA并提交GenBank,登录号为DQ017265,核酸序列比对表明东毕吸虫肌动蛋白基因的核苷酸序列和日本血吸虫、曼氏血吸虫的同源性分别为90%和91%.结论土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白的全长cDNA的克隆为进一步表达及其生物学性能的分析提供了理论基础.     

广西猪瘟流行毒株全基因组的克隆与序列分析

参考已发表的猪瘟病毒(CSFV)Shimen株、HCLV株、Paderborn株的核苷酸序列，设计并合成11对引物。应用RT—PcR技术，成功地分11个片段扩增了CSFV广西流行毒株GXWZ02的全基因组，将这11个基因片段克隆，并测定了其核苷酸序列。应用计算机生物软件Vector NT1将11个基因片段进行拼接。确认CSFV GXWZ02株全基因组序列的长度为12296个核苷酸(GenBank收录号AY367767)。将GXXZ02株与国内外已发表的Slhimen、HCLV、39、Brescia、Eystrup、Glentorf、Alfort187、Pader190rn、CS、ALD、GPE、P97、LPC毒株进行全基因组核苷酸序列和推定的氨基酸序列比较，核苷酸同源性分别为85．4％、84．6％、88．7％、85．7％、85．7％、85．3％、85．6％、95．3％、85．7％、85．7％85．4％、83．4％、84．3％，推定的氨基酸同源性分别为92．6％、91．7％、94．2％、93．1％、92．9％、92．3％、93．0％、97．7％、92．6％、93．0％、92．6％、90．5％、90．6％。GXWZ02与Shimen、HCLV的全基因组序列及推定的氨基酸序列有明显差异，表明GXWZ02株在遗传性和抗原性上发生了较明显的变化。系统发育树分析，所比较的14株CSFV被分为2个群：GXWZ02、Paderborn和39这3个毒株被归为群Ⅰ，其余的11个毒株被归为群Ⅱ，GXWZ02与Paderborn的亲缘关系最接近。将GXXZ02与Shimen、HCLV基因组中单个基因分别进行核苷酸及推定的氨基酸序列同源性比较，结果显示，基因E^ms、E2、P7、NS2、NS5A的遗传变异程度大。而NS3、NS4A、NS4B的遗传性则相对保守。     

H1N1猪流感广东株血凝素基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法扩增H1N1亚型猪流感病毒广东分离株A／Swine／GuangDong／711／2001HA基因，对其进行了克隆和测序。结果显示，HA基因全长1771bp．共编码579个氨基酸。A／Swine／Guang Dong／711／2001HA基因编码的氨基酸序列中有8个糖基化位点，5个位于HAl基因的第27、28、40、104和287位点，3个位于HA2基因的21、153和213位点。与H1N1亚型猪流感经典毒株比较后发现，血凝素糖基化位点并不是高度保守的。将A／Swine／Guang Dong／711／2001与自Gen Bank读取的1918年人流感毒株A／South Carolina／1／18、1991年人流感毒株A／MD／12／91和1997年猪流感毒株A／Swine／Wisconsin／238／97等进行核苷酸同源性比较分析，A／Swine／Guang Dong／711／2001与A／SouthCarolina／1／18、A／MD／12／91和A／Swine／Wisconsin／238／97等毒株的核苷酸同源性分别为93．9％、94．7％和93．9％。从系统发生树来看，A／Swine／Guang Dong／711／2001与A／South Carolina／1／18和A／Swine／Wisconsin／238／97的亲缘关系相近。     

一株鸭源禽流感病毒（H9N2）全基因序列分析及其排毒规律的研究

为研究一株鸭源H9N2亚型禽流感病毒(JN1株)全基因组的分子特征和遗传进化情况以及感染雏鸭后的排毒规律,对其生物学特性、全基因组序列以及遗传进化进行了分析,通过点眼滴鼻方式感染3周龄健康雏鸭,利用建立的实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测鸭的排毒规律,并测定血清抗体效价。JNI株的鸡胚半数感染量为10~(-7.54)/0.2mL,鸡胚最小致死量的平均死亡时间为72h,静脉致病指数为0.266,抗原相关系数为0.47。系统发育分析表明,JN1株的HA与CK/HK/G9/97和DK/HK/Y280/97在同一分支上,NA、M、NP、PA、PB1、PB2基因与SH/F/98同源性较高,NS基因则与H5N1亚型禽流感病毒进化关系较近。HA的裂解位点为PSRSSR↓GL,存在6个潜在糖基化位点,在234位的氨基酸残基为L,NA基因颈部存在缺失。雏鸭在感染该病毒后,饮食正常,精神良好,3~17d均有排毒,咽拭子和泄殖腔棉拭子排毒规律基本一致,分别在第3天和第13天出现排毒高峰。该H9N2亚型禽流感病毒属欧亚大陆分支,为低致病性禽流感,病毒可通过呼吸道和泄殖腔向外界排毒,排毒时间较长。     

不同轮作序列对旱地胡麻土壤有机碳稳定性的影响

为了探索陇中黄土高原半干旱丘陵沟壑区胡麻轮作序列对土壤碳库的影响,2012-2016年通过4年定位试验,以连作为对照,研究了不同胡麻频率下的轮作序列(F:休闲;PWFW:25%Flax、马铃薯-小麦-胡麻-小麦;WFWP:25%Flax、小麦-胡麻-小麦-马铃薯;FWPF:50%Flax、胡麻-小麦-马铃薯-胡麻;WPFF:50%Flax、小麦-马铃薯-胡麻-胡麻;FFFF:100%Flax、胡麻-胡麻-胡麻-胡麻)对土壤团聚体、总有机碳(TOC)、土壤颗粒有机碳(POC)、土壤微生物碳(MBC)和氮(MBN)的影响。结果表明,休闲、不同轮作序列和低胡麻频率显著增加了030 cm土层<0.25 mm粒级的土壤团聚体含量、TOC和POC含量,而随胡麻频率的增加三者的含量呈下降趋势。其中,25%Flax处理下土壤团聚体含量较播前和休闲处理分别显著增加了2.02%4.04%和9.56%11.73%;土壤有机碳(SOC)较连作显著增加5.95%7.48%。50%Flax处理下胡麻位置对土壤SOC影响显著,且轮作(FWPF)显著高于连作(WPFF)。060 cm土层土壤SOC含量表现为休闲>播前≈25%Flax>50%Flax>100%Flax。与连作相比,轮作显著提高了010 cm土层土壤TOC和POC含量,呈现表层富集现象。土壤POC含量表现为25%Flax≈休闲>50%Flax>100%Flax。此外,轮作换茬显著增加了土壤MBC含量,且随着胡麻频率的增加,030 cm土层土壤MBC含量逐渐降低。与播前、休闲、轮作相比,连作显著降低土壤微生物碳氮比,50%Flax(WPFF)轮作序列和土层深度对土壤有机碳和微生物量的互作效应显著。综合来看,休闲可以显著改善土壤理化性状,25%胡麻频率的轮作序列利于保持土壤团聚体稳定性,增加土壤TOC、SOC和POC含量,而50%Flax轮作序列(WPFF)能够提高土壤微生物量和微生物碳氮比。表明25%胡麻频率的轮作序列均可维持土壤有机碳的稳定性,是旱地胡麻比较理想的轮作序列。     

Salmonella Gallinarum field isolates and its relationship to vaccine strain SG9R

1. The aim of the present study was to determine if the 9R-strain of the Salmonella Gallinarum live vaccine was responsible for having fowl typhoid outbreaks in chicken flocks from both chicken and turkey breeders as well as to verify the antimicrobial resistance of the isolates from the outbreaks.

2. The triplex polymerase chain reaction, standard antimicrobial test, beta-lactamase genes identification and Ion Torrent PMG whole-genome sequence were used in the field isolates and in the vaccine strain of S. Gallinarum.

3. The 60 tested isolates were not from vaccine origin and manifested high resistance to drugs from macrolide and quinolone groups. Whole-genome sequencing (WGS) and single nucleotide polymorphism analysis on selected isolates for core genes from Salmonella enterica confirmed the wild origin of these isolates and showed two possible sources of S. Gallinarum in the studied outbreaks.

4. S. Gallinarum isolated from fowl typhoid outbreaks in the studied period were not caused by the use of the SG9R live vaccine. The source of strains sequenced was diverse.     

蛋鸡OC-116基因的克隆和序列分析

参考原鸡（G. gallus） OC-116编码基因序列（登录号：NM_204569.1）设计3对引物，特异性地从仙居鸡子宫组织中克隆OC-116编码基因的N端、中段和C端，测序鉴定后通过酶切连接获得家鸡OC-116的全长编码基因。根据本研究的测序结果，初步发现突变概率较高的碱基有：第1233位（A→G）、1336位（C→G）、1358位（T→G）、1391位（T→G）、1491位（T→G）、1754位（G→T）、1841位（T→C）、1843位（C→T）、1983位（C→T）和2057位（T→C）；其中第1358,1754,1841,1983和2057位的碱基突变均为同义突变，第1233、1336、1391、1491和1843位是错义突变。而且突变碱基主要属于T：G颠换类型，其次是T：C转换类型。另外根据同源性分析，家鸡的OC-116编码基因在进化过程中很保守。总之，本研究已经从仙居鸡子宫组织中克隆到OC-116编码基因，为进一步研究该基因的功能奠定基础。