雷公藤hmgr基因克隆、序列分析及诱导表达

【目的】克隆雷公藤萜类生物合成途径限速酶HMGR的编码基因,并分析雷公藤叶悬浮细胞中该基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达水平,为雷公藤萜类生物碱的生物合成提供理论依据。【方法】根据GenBank中报道的限速酶HMGR的编码基因序列合成简并引物,采用RT-PCR、5′-RACE和3′-RACE方法从雷公藤叶片中获得hmgr基因的cDNA全长序列;用生物信息学方法对限速酶HMGR进行蛋白结构及功能分析;用半定量RT-PCR方法比较hmgr基因在不同质量浓度壳寡糖诱导下的表达差异;用HPLC分析不同质量浓度壳寡糖诱导下雷公藤叶悬浮细胞中3种萜类次生代谢物(内酯醇、吉碱和次碱)的含量。【结果】获得了雷公藤中编码限速酶HMGR的基因全长cDNA序列,该序列开放阅读框长为1 860bp,编码579个氨基酸。生物信息学分析表明,雷公藤hmgr基因编码的蛋白分子质量为61.678ku,等电点为6.98,蛋白质稳定性参数为41.33,为不稳定蛋白质,氨基酸序列包含2个与NADPH结合的位点(DAMGMNM和VGTVGGGT)及2个与HMG-CoA结合的位点(EMPVGYVQIP和TTEG-CLVA)。半定量RT-PCR结果表明,经50mg/L壳寡糖诱导12h的雷公藤叶悬浮细胞中hmgr基因表达最强,且在该诱导条件下细胞中的内酯醇、吉碱和次碱的含量也有不同程度的提高。【结论】雷公藤HMGR蛋白可能为甲羟戊酸(MVA)途径中的限速酶,编码该蛋白的hmgr基因可促进雷公藤萜类物质的合成。     

雷公藤ISSR反应体系的建立与优化

[目的]建立适合雷公藤的ISSR-PCR反应体系,为雷公藤种质资源的亲缘关系鉴定和遗传多样性分析提供技术支持.[方法]采用单因素试验设计优化影响雷公藤ISSR-PCR扩增效果的Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物浓度和DNA模板含量及退火温度,并以32份雷公藤样品对优化的ISSR-PCR反应体系进行验证.[结果]优化的雷公藤种质资源ISSR-PCR反应体系为:20.00μL反应液中含1.50 U Taq DNA聚合酶、0.30 mmol/L dNTPs、2.00 mmol/L Mg2+、0.40μmol/L引物、20 ng DNA模板和2.00μL 10×Buffer.ISSR-PCR扩增程序中最佳退火温度为54.7℃.[结论]建立优化的雷公藤ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性、重现性和适用性,可应用于雷公藤不同地理种源间的遗传多样性鉴定.     

Four new neolignans from the leaves of Tripterygium wilfordii

Four new neolignans, wilfordiols A-D (1-4), together with five known compounds (5-9), were isolated from an aqueous extract of the dried leaves of Tripterygium wilfordii. Their structures were determined by spectroscopic methods, including 1D and 2D NMR, HRESIMS, and CD experiments. The anti-inflammation activities of compounds 1-9 were evaluated by the inhibitory effect on NO production, in vitro.     

雷公藤角斑病菌产毒条件研究

对雷公藤角斑病菌福木假尾孢(Pseudocercospora elaeodendri)毒素的生物活性进行测定。结果表明,该菌所产生的毒素对雷公藤叶片具有毒性。生物活性测定方法选择离体叶片针刺法。对雷公藤角斑病菌产毒条件研究表明,该菌产毒的最佳培养液为查彼+培养液,最适pH值为7.0,适宜温度为29℃,并在全黑暗条件下充分震荡(120 r.min-1)培养25 d。     

黄花梨园套种雷公藤栽培模式研究

为探索黄花梨发展的新途径,开展了黄花梨园套种雷公藤的试验.结果表明:在黄花梨高干稀植条件下套种雷公藤,与单一的黄花梨矮化密植栽培方式相比,黄花梨地径增加26.7%,主枝延长枝长度和粗度分别增加12.6%和5.3%,冠幅增加46.5%,单株产量提高29.9%,单果重增加14.8%,大果率增加4.2个百分点,糖分和可溶性固形物含量分别提高0.36和0.8个百分点.叶片与果实病虫害明显减轻.雷公藤基径1.4 cm,每丛11支,生长发育正常.     

雷公藤总生物碱对摇蚊幼虫杀灭活性和谷胱甘肽硫转移酶的影响

【目的】研究雷公藤总生物碱对摇蚊4龄幼虫的杀灭活性、谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性以及GST相关基因表达的影响。【方法】以摇蚊4龄幼虫为试虫,分别用5,10,15μg/L雷公藤总生物碱进行处理,以用丙酮处理为对照,24~72 h后观察幼虫反应,测定雷公藤总生物碱对摇蚊幼虫的致死中浓度(LC50)及谷胱甘肽硫转移酶活性,并用RT-PCR方法,检测了摇蚊11个GST基因的表达情况。【结果】雷公藤总生物碱对摇蚊4龄幼虫具有杀灭活性,24,48,72 h的致死中浓度(LC50)分别为33.019,19.092和16.760μg/L。在亚致死质量浓度(5,10,15μg/L)下,雷公藤总生物碱对摇蚊4龄幼虫谷胱甘肽硫转移酶活性具有显著的抑制作用,与同期对照相比,酶活性最大下降幅度分别为73.49%(以1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)为底物)和73.20%(以3,4-二氯硝基苯(DCNB)为底物)。RT-PCR检测结果显示,在摇蚊11个谷胱甘肽硫转移酶基因中,有2个基因(CtGSTu3和CtGSTu4)在mRNA水平上被诱导上调表达,且mRNA表达量随着雷公藤总生物碱质量浓度的增加而升高,存在着剂量依赖关系。【结论】雷公藤总生物碱对摇蚊幼虫具有较高的杀灭活性,有被开发为摇蚊控制剂的潜能。在亚致死质量浓度(5~15μg/L)处理下,雷公藤总生物碱能显著抑制摇蚊谷胱甘肽硫转移酶活性,并诱导CtGSTu3和CtGSTu4 mRNA上调表达。     

培养基及培养条件对雷公藤愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响

以MS,B5,NT,H,1/2MS,6,7-V及White为基本培养基,分别添加1.0mg·L-12,4-D和0.5mg·L-1KT,分析不同类型培养基对雷公藤愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响,并以NT为基本培养基进行光照条件、pH值、接种量、不同外植体以及培养时间试验,探讨雷公藤愈伤组织生长及次生代谢产物含量的最佳培养条件。结果表明:6,7-V培养基有利于愈伤组织生长和继代保存,White培养基上雷公藤内酯醇及雷公藤总生物碱含量最高,NT培养基适合进一步继代培养。pH5.8时,最有利于愈伤组织生长,pH6.7时雷公藤内酯醇的含量最高,而雷公藤总生物碱含量在pH5.2时最高;光照处理中,暗光不仅有利于愈伤组织生长,也有利于雷公藤内酯醇及雷公藤总生物碱的积累,且褐化程度较轻。根愈伤组织增长量、雷公藤内酯醇含量最高,而叶愈伤组织中雷公藤总生物碱的含量最高。愈伤组织最适继代时间为40～45天,雷公藤内酯醇及雷公藤总生物碱的产量在第50天时最高。     

雷公藤高内酯醇含量无性系的早期选择

2年生雷公藤无性系苗木的根韧皮部、根木质部的内酯醇含量质量分数分别为0.0024%、0.0031%,根木质部的内酯醇含量是根韧皮部的1.29倍;23个无性系苗木的根韧皮部、根木质部的内酯醇含量差异达显著水平;通过联合选择,选出2个高内酯醇含量无性系、1个兼有速生及高内酯醇含量双优性状的优良无性系。     

低磷胁迫对雷公藤幼苗光合特性的影响

采用土培的方法,研究了6个浓度的磷胁迫对雷公藤1和3年生幼苗一个生长季内叶片的净光合速率（ Pn ）、蒸腾速率（ Tr ）、气孔导度（ Gs ）、胞间CO2浓度（ Ci ）和叶绿素含量（ Chl）等光合生理指标的影响。结果表明：不同程度低磷处理对1和3年生雷公藤Pn、 Tr、 Gs、 Ci 和Chl影响差异显著（P＜0．05）,随着胁迫时间延长大致呈下降趋势,并随胁迫程度加重,显著降低,1年生雷公藤对低磷胁迫的响应更为灵敏,环境温度波动对雷公藤Pn、 Tr的季节变化影响大,而对3年生雷公藤叶片Chl影响较小,高温会抑制雷公藤的Pn、 Tr ,3年生雷公藤比1年生雷公藤更耐高温。雷公藤幼苗对缺磷环境有一定的调节适应能力,在轻度（20 mg· kg－1）和中度（15、10 mg· kg－1）缺磷水平的林地上可维持保证植株光合作用正常进行,而重度（5、0 mg· kg－1）缺磷条件下会对其叶片光合机构造成破坏,从而影响其生长发育,而低磷胁迫下3年生雷公藤相对于1年生雷公藤具有较好的适应能力,能够更好的适应中度和轻度缺磷的土壤条件。     

雷公藤以芽繁芽组织培养研究

以雷公藤茎段为材料,用正交试验设计来寻找其组织培养的最佳配方,结果表明：芽段在MS＋NAA0．01mg／L培养基中,可萌动产生新叶和新芽;在增殖培养中,以1／2MS＋6-BA1mg／L＋NAA0．2mg／L组合月增殖系数最大,达5．38,且芽生长最好;在生根培养中,以1／2MS＋ABT-1^#0．6mg／L＋IBA0．3mg／L的生根率最高,达80．8％。