Sequence analysis and prokaryotic expression system construction of PIA genes isolated from Neisseria gonorrhoeae

AIM: To analyze the nucleotide and putative amino acid sequences of PIA genes isolated from N.gonorrhoeae and to construct the prokaryotic expression system of PIA gene.METHODS: The entire PIA genes from 9 strains of N.gonorrhoeae were amplified by using high fidelity PCR.The target amplification fragments were sequenced after T-A cloning.Homology comparison of the nucleotide and putative amino acid sequences of PIA genes from the isolates with the reported sequences in GenBank was then performed.A prokaryotic expression system of PIA gene was constructed.Different dosages of IPTG were applied to induce the expression of the target recombinant protein (rPIA) and 10% SDS-PAGE plus Bio-Rad Agarose Image Analysor was used to determine the expression level of rPIA.rPIA was extracted using Ni-NTA affinity chromatography and the purified effect was detected by SDS-PAGE.RESULTS: In comparison with the reported PIA gene sequences (GenBank No: L19962),the homologies of nucleotide and putative amino acid sequences of PIA genes from the isolates were 99.6%-100% and 99.1%-100%,respectively,which indicated that all the isolates were belonging to serovars IA6.Output of rPIA was as high as 50.1% of the total bacterial proteins.The purified rPIA only showed a single target protein fragment in gel.CONCLUSION: Serovar IA6 is dominant in the local N.gonorrhoeae isolates and sequences of the encoding gene are relatively conserved.The constructed prokaryotic expression system is able to express rPIA with high efficiency,which may lay a foundation for further development of serological detection kit and vaccine of N.gonorrhoeae.     

植物病原丝状真菌寄生性与RGS蛋白的关系研究

以49个全基因组序列已经公布的真菌为研究对象，通过OrthoVenn2同源基因簇比对、BLASTp比对和关键词搜索3种方法对G蛋白信号调控因子（regulators of G-protein signaling，RGS）同源基因进行比对分析，并结合SMART进行保守结构域分析，结果发现，49个真菌中共有229个RGS蛋白，每种真菌中所含有RGS蛋白的数量范围为3~9个，且死体营养型病原菌和半活体营养型病原菌的RGS蛋白数量高于活体营养型病原菌；根据RGS蛋白中保守结构域进行分类，可以划分为DEP-RGS、RGS-TM、PXA-RGS-PX、RGS、RGS-PAS-PAC、TM-RGS等6种，其中，具有RGS-PAS-PAC和TM-RGS这2种特殊保守结构域的RGS蛋白主要集中在半活体营养型病原菌和死体营养型病原菌；进一步对229个RGS蛋白进行遗传关系分析，发现具有同种保守结构域的RGS蛋白亲缘关系较近。上述研究结果表明植物病原丝状真菌的寄生性与RGS蛋白数量和种类之间存在着一定的关联性。     

中国野生葡萄抗黑痘病基因RAPD标记的克隆、序列分析及辅助育种应用

对中国野生葡萄抗黑痘病基因RAPD标记OPS03-1300进行了克隆、测序及序列分析,结果表明该标记实际长度是1354bp,因此更名为OPS03-1354,其GenBank登录号为DQ350885。该标记序列与99条来自欧洲葡萄的EST有同源性,其中与1条来自赤霞珠叶片感染葡萄皮尔斯病病原菌后获得的EST同源性为82%,与2条来自赤霞珠果实在不同发育期获得的EST同源性分别为80%和85%。该序列与1条来自中国野生华东葡萄白河-35-1叶片接种霜霉病病原菌后获得的EST同源性为67%。该序列编码葡萄的一种假定蛋白。此外,应用该标记对中国野生葡萄与欧洲葡萄的种间杂交广西-1×京可晶F1代339株、白河-35-1×佳利酿F2代207株进行了辅助选择。     

中小跨径弯斜桥的几何设计探讨

弯斜桥梁的几何设计思路是影响设计、施工的重要因素，文中提出了桥梁受公路线形制约时的几何布置形式，公路弯斜桥几何设计的特点、类型、方法和影响因素。在不增加设计难度的情况下，通过桥梁的几何布置达到改善公路线形的目的。结合黑龙江省望奎至灵山乡公路桥梁设计的实例加以说明。     

家蝇幼虫双翅肽MdDpt I成熟肽基因的克隆与原核表达

对鸡沙门氏菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库(SSH)中筛选得到的家蝇双翅肽I(Musca domesticaDiptericin I,MdDptI)基因进行克隆、表达,并对表达产物的抑菌活性进行初步研究。以沙门氏菌诱导家蝇幼虫cDNA为模板,采用cDNA末端快速扩增技术(RACE),对MdDptI基因进行扩增,并对扩增产物进行测序和生物信息学分析,进一步去掉信号肽并构建重组表达质粒pET-28a-MdDptI,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。借助亲和纯化获得目的蛋白,并验证目的蛋白的生物活性。MdDptI基因全长为419 bp,包含一个300 bp的完整开放阅读框(ORF),编码99个氨基酸,其cDNA序列与GenBank中登录号为FJ794602.1的家蝇双翅肽基因同源性为95%。构建了家蝇MdDptI基因的成熟肽原核表达质粒pET-28a-MdDpt-I,并获得成功表达,表达产物约为12 ku,与预期结果一致。纯化后的目的蛋白表现出一定的抑菌活性。本试验获得了MdDptI基因的全长序列,构建了原核表达载体,并成功获得表达纯化。     

METTL21C蛋白的序列特征、三维结构及分子进化

METTL21C蛋白作为甲基转移酶参与多种细胞进程的翻译后修饰,在生命活动中发挥重要的调控作用。从蛋白质信息数据库UniprotKB中选取36个不同代表物种的METTL21C蛋白作为研究对象,理化参数分析显示一级序列中氨基酸残基个数差异较大,平均为254个氨基酸残基,大多为偏酸亲水性蛋白。系统进化树显示36种METTL21C蛋白共分为哺乳类、爬行类、鸟类和鱼类4支,与物种的亲缘进化关系基本吻合。多序列比对和motif分析结果表明不同物种METTL21C蛋白的序列相似度较高,10个motif序列几乎覆盖了全长多肽链,大都含有motif 1～motif 5,但N端序列差异较大,在哺乳动物中包含特有的motif 7、motif 8和motif 10,而在多种鸟类中有大段序列缺失。结构对比分析发现不同物种METTL21C蛋白的空间构象绝大部分区域近乎完全重叠,仅少部分自由度较高的局部肽段有一定程度的差异,表明不同物种METTL21C在进化过程中一级序列有一定的差异,但是空间结构极为相似。以人METTL21C为蛋白质互作网络中心,直接相关蛋白质共11种,间接相关蛋白质共9种,说明METTL21C直接或间接参与多种细胞进程,调控机体的生命活动,为进一步深入研究METTL21C的生物学功能及其分子机制提供了理论基础。     

Identification of the putative ancestral allele of bovine single‐nucleotide polymorphisms

Identifying the action of natural selection from patterns of standing genetic variation has long been of interest to the population genetic community. Thanks to the availability of large single‐nucleotide polymorphism (SNP) data sets for many species and of high‐throughput SNP genotyping methods, whole‐genomic surveys to detect selective sweeps are now possible. Knowing the ancestral allele increases the power to detect selection. We present here a comparative genomic approach to determine the putative ancestral allele of bovine SNPs deposited in public databases. We analysed 19 551 488 SNPs and identified the putative ancestral allele for 14 339 107 SNPs. Our predicted ancestral alleles were in agreement with ancestral alleles detected by genotyping outgroup species for 97% SNPs from the BovineSNP50 BeadChip. This comparison indicates that our comparative genomic‐based approach to identify putative ancestral alleles is reliable.     

对虾病原菌2—5B菌株16SrRNA基因片段的克隆和序列测定

用引物ＰＬ１－ＰＬ２ＰＣＲ扩增对虾病原菌－坎普氏弧菌２－５Ｂ菌株１６ＳｒＲＮＡ基因－１２２３ｂｐ的片段，采用ｐＵＣ１９质粒构建ｄＴ载体法完成该片段的克隆。部分序列测定及分析结果表明，该菌株与ＧｅｎＢａｎｋ中坎普氏弧菌标准株序列之间同源性为９６．９４％。     

陕西关中某羊场羊口疮病毒的分离鉴定与基因序列分析

羊口疮疫病的暴发可严重影响畜牧的经济效益,为探明陕西地区该病的发病原因。本研究从陕西关中地区某羊场出现特征症状病羊嘴部痂皮中分离病原,经过感染MDBK细胞系,获得1株病毒,经形态学、理化学、PCR检测及病理组织学等方法鉴定,该病毒分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为ORFV-SXGZ。依据GenBank中发表的ORFV特异性B2L、F1L及VIR基因的核酸序列,设计并合成3对引物,应用PCR方法成功对ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L及VIR基因进行克隆,并将其基因序列及推导的氨基酸序列与其他不同来源ORFV分离株进行比较分析。序列分析结果表明,ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L和VIR基因与其他已发表ORFV毒株之间的核苷酸同源性分别为96.7%~99.6%、95.8%~97.9%和95.0%~99.3%,氨基酸同源性分别为95.3%~99.7%、95.8%~98.2%和95.5%~98.4%。系统进化树分析结果显示,ORFV-SXGZ毒株与国内新疆和甘肃等西北部地区分离株的亲缘关系更近,证实陕西关中地区养殖场中存在羊口疮病毒感染。     

浅色黄姑鱼线粒体16S rRNA基因片段序列特征分析

PCR扩增100个浅色黄姑鱼个体的线粒体16SrRNA基因片段序列,得到大约620bp的扩增产物。将其中5个个体的扩增产物进行测序和同源比对,得到468bp可供比对分析的片段。比对结果表明,5条序列包括两个单倍型,两个单倍型之间有1个碱基突变。PCR-RFLP分析结果显示,两个种群的100个样品中98%的个体为其中一种单倍型,只有2%的个体呈另一种单倍型,表明这两个种群的遗传多样性较低。两个单倍型平均碱基组成为:T22.0%,C26.3%,A29.8%,G21.9%,GC含量平均为48.2%。与GenBank中石首鱼科7属9种的11条同源序列比对,得到429个比对位点,其中包括69个简约信息位点、55个单突变子和16个插入/缺失位点。聚类分析显示,浅色黄姑鱼与黄姑鱼亲缘关系较近,与形态分类相符。