猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF1基因的扩增测序与序列分析

合成一对猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)ORF1基因特异性引物,对分离到的郑州分离株(ZZ株)猪圆环病毒PCV-2型的ORF1基因进行了扩增,经测序后,将所测序列与已公布的35株PCV-2ORF1序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株间的ORF1基因核苷酸同源性为97.3%～100%;进化树分析表明各分离毒株ORF1基因在进化上比较保守。同时对PCV-2OFR1部分功能进行分析,发现该基因蛋白具有良好的抗原性。     

猪外周血单核细胞来源的树突状细胞体外诱导培养

[目的]建立猪外周血单核细胞来源的树突状细胞(MoDC)体外培养模型.[方法]从猪外周新鲜血液中分离外周血单核细胞(PBMC),通过贴壁法获得树突状细胞前体细胞,采用重组猪的集落共刺激因子(rpGM-SCF)和重组猪的白细胞介素4(rpIL-4)双因子诱导及脂多糖(LPS)刺激成熟法,收集不同时间段的细胞,利用扫描电子显微镜观察其形态,流式细胞分析仪检测表面分子表达率及其对FITC-dextran的吞噬能力,混合淋巴细胞反应检测细胞对同种异体T细胞的刺激能力.[结果]经体外诱导的DC具有典型的树突状形态;LPS刺激的DC表型分子CDla、CD80、CD86、SLAⅡ、CD172a与LPS未刺激的DC有明显增高,其吞噬能力有所下降,刺激同种异体T淋巴细胞的能力有所增强.[结论]该试验成功建立了猪MoDC的体外诱导培养方法,为进一步研究猪MoDC在机体免疫调节和抗病毒感染中的作用奠定了基础.     

PCV2·ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化

[目的]为了研究PCV2-ORF2基因片段在大肠杆菌中的表达与纯化。[方法]用PCR方法扩增PCV2 ORF2基因3′端片段,PCR产物经酶切后与经同样处理过的pET32a质粒连接,构建重组质粒。重组质粒经PCR和酶切鉴定并测序后,转化BL21感受态细胞;重组菌液用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。[结果]ORF2基因在大肠杆菌中正确表达,表达的融合蛋白的分子量约为33 ku;在37℃、1 mmol/L浓度下,诱导时间为6 h时表达量最大,占细菌总蛋白的23.62%。表达产物主要以包涵体的形式存在,将包涵体溶解后过Ni-NTA柱纯化可得到较为纯净的目的蛋白。[结论]该研究为猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)和猪皮炎和肾病综合征(PDNS)等疾病的防治奠定了基础。     

猪圆环病毒2型的致病机理和疫苗研究进展

为了深入了解猪圆环病毒2型的致病机理和疫苗研究进展,介绍了猪圆环病毒2型感染引起猪免疫系统的损伤过程,其他病原对该过程的促进和诱导作用,刺激免疫系统影响病毒复制和临床病例发生,综述了有关疫苗研究情况。国内外在猪圆环病毒2型的致病机理和疫苗研究进展上有很多相关研究报道,可供借鉴。研究为探讨运用疫苗途径来预防控制该病的发生提供了依据。     

PCV-2感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响

【目的】了解猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】运用荧光定量PCR技术,测定和分析PCV-2感染PK-15细胞后0(未接种病毒),1,6,12,24,48,72 h时病毒DNA含量及细胞因子IFN-βI、FN-γI、FNAR-1I、FNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、MX1、NOS、RNaseL和IRF-3 mRNA转录水平的变化。【结果】PCV-2感染PK-15后1 h就可以检测到病毒DNA,在感染后24 h病毒开始大量迅速增殖,于感染72 h时达到最高峰。与0 h相比,PCV-2感染后IFN-βI、RF-3的表达量在感染12 h时显著增加,其他时间表达量下降;IFN-γ、MHC-Ⅱ的表达量在感染12 h时增加不明显,其他时间表达量下降;感染PCV-2后IFNAR-2、MHC-Ⅰ、MX1的表达量下降;RNaseL的表达量在感染12 h时显著减少,其他时间表达量增加,48 h时表达量增加显著;IFNAR-1的表达量在感染72 h时显著增加,其他时间表达量下降;未检测出NOS的表达。【结论】随着PCV-2病毒含量的增加,以上几种主要抗病毒因子的表达量不明显或有所下降,表明PCV-2感染PK-15细胞后可逃避机体的抗病毒作用机制。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活疫苗安全性和免疫原性测定

选用猪繁殖与呼吸综合征病毒福建分离株(PRRSV Fuzhou 01株)为制苗种毒。病毒经Marc 145细胞增殖、超速离心浓缩、甲醛灭活后,分别制成新型佐剂IMS1312灭活疫苗和油乳剂灭活疫苗,两种疫苗病毒含量约为108.0TCID50.mL-1。30头25日龄的PRRSV抗体阴性的断奶猪被随机分成5组,每组6头,用于检测疫苗的安全性和免疫原性。结果表明两种疫苗首次免疫断奶仔猪后14 d可以检测到抗体,二免14 d抗体水平达到高峰,一免180 d后抗体水平可以维持在1∶320。两种佐剂苗在4℃放置12个月均不分层,并对断奶仔猪具有良好的安全性和免疫原性。     

表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌的构建

利用Oligo设计合成一对引物P1、P2,分别含有BamHI和XhoI酶切位点,以猪细小病毒株LJL12的DNA为模板,采用PCR技术扩增VP2基因,克隆到pMD18-TSimple载体,并进行酶切、PCR鉴定和序列测定。将VP2基因分别亚克隆到干酪乳杆菌细胞表面表达型载体pPG1和分泌型表达载体pPG2的BamHI和XhoI酶切位点,电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei393,获得阳性重组菌株。成功构建了猪细小病毒VP2蛋白的干酪乳杆菌表达系统,命名为pPG1-VP2/L.casei393和pPG2-VP2/L.casei393。     

猪体外成熟卵母细胞的电激活及其激活后的体外培养

 主要研究了猪体外成熟卵母细胞电激活的条件以及孤雌激活胚胎的体外培养体系。用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活猪体外成熟的卵母细胞。结果表明 ,在本试验条件下电激活最佳场强和脉冲时程为 130V·mm-1/ 80 μs ,其囊胚发育率为 (2 0 .12± 8.18) % (P >0 .0 5 )。多次脉冲并不比单次脉冲的激活效果好 (P >0 .0 5 )。孤雌激活胚胎用不同培养方式和气体环境在体外培养 7d ,发现 7d不换液与第 5天换液和第 5天换含 10 %胎牛血清的培养液其囊胚发育率 [分别为 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、(2 6 .4 4± 8.35 ) %和 (17.6 8± 5 .39) % ]无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,后两者换液培养方式其囊胚细胞数 (15 .78± 5 .4 6、14 .5 5± 4 .81)明显低于不换液的 (18.0 1± 6 .79,P <0 .0 1)。同时发现低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养的胚胎囊胚发育率和囊胚细胞数和高氧环境 (5 %CO2 的空气 )无明显差别 ,分别为 [(2 0 .78± 8.80 ) %、17.0 0± 6 .12和 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、18.0 1± 6 .79,P >0 .0 5 ]。表明激活后第 5天换原液和换含胎牛血清的培养液不能提高囊胚细胞数。低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养猪胚胎的效果不比高氧环境 (5 %CO2 的空气 )好。     

猪圆环病毒分子生物学研究进展

猪圆环病毒是单链环状DNA病毒,其基因组中包含多个阅读框,其中2个主要的阅读框分别编码复制起始蛋白Rep和Rep'以及病毒衣壳蛋白:Rep和Rep'结合由PCV1的部分复制起点组成的双链DNA片段,但这2种蛋白的结合位点有细微差别;Rep蛋白不能单独启动病毒的复制,只有和Rep'蛋白一起才能启动PCV病毒的复制;PCV1感染PK15细胞后,用实时PCR检测rep和rep'转录子的数量,发现这2种转录子的比率随着时间的推移而不断发生变化;病毒衣壳蛋白基因是PCV基因间唯一变化很大的基因,其编码衣壳蛋白是PCV主要的免疫原性蛋白,其氨基端41个氨基酸与PCV2在细胞核内的定位有关.     

利用单根肌纤维法分离和培养猪骨骼肌卫星细胞及其成肌诱导分化

建立单根肌纤维法体外培养猪骨骼肌卫星细胞的体系,了解其增殖和成肌特性。通过Ⅰ型胶原酶消化,从猪骨骼肌中分离完整的单根肌纤维并培养,用细胞免疫荧光鉴定肌纤维上的卫星细胞,随后对从单根肌纤维上游离出来的卫星细胞进行细胞免疫荧光染色,传代培养,成肌诱导分化和Western blot分析骨骼肌卫星细胞成肌特异性蛋白的表达。结果显示:分离并培养的单根肌纤维上附着有卵圆形的细胞,并随时间的推移,细胞缓慢向外迁移并增殖,卫星细胞特异性标志基因对盒转录因子(Paired protein box,Pax7)和成肌分化抗原(Myogenic Differentiation Antigen,MyoD)免疫荧光染色呈阳性,且阳性率达到90%以上。成肌诱导分化后,细胞开始汇合,并呈方向性生长,最终形成多核肌管,且成肌特异性标志基因Myogenin和myosin heavy chain(MyHC)表达呈阳性。MyoD蛋白高表达于增殖期,而Myogenin和MyHC在进入分化期才表达。该实验成功建立了猪骨骼肌单根肌纤维的体外培养方法并获得了高纯度的卫星细胞,为骨骼肌卫星细胞进行活体移植治疗相关疾病研究提供了实验材料。