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本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88的热不稳定性肠毒素(heat-labile toxin,LT)基因进行无痕敲除并获得K88 LT-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。 相似文献
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茶树咖啡碱合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
CRISPR/Cas9技术是一门新兴的基因组定点编辑技术,具有操作简单、高效的优点,可轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变等操作。该技术刚诞生,就受到了全球生命科学领域研究者的关注,不到3年的时间就已经成功应用于多种动、植物当中。然而CRISPR/Cas9技术在茶树中的应用面临载体构建问题,本文以茶树咖啡碱合成酶为例,联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术,构建了包含茶树咖啡碱合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(3):443-447
探讨鸡大肠杆菌bla_(CTX-M-9)的遗传背景和毒力因子流行特征,为进一步研究bla_(CTX-M-9)与致病特性是否相关奠定基础。取近年来收集的17株产CTX-M-9族鸡大肠杆菌为研究对象,分别采用定位PCR、多重PCR等技术检测受试菌株的种系发育、MLST序列、质粒复制子特性、bla_(CTX-M-9)的上、下游基因环境及其携带的31种毒力基因。结果显示,bla_(CTX-M-9)的上游均含有ISEcpl,部分被IS26截断,下游最常见的是IS903。受试菌ST分型多样化,17株菌分别属于12种不同的ST型。受试菌携带3种以上复制子,最常见的是IncFII复制子,其次为IncFIB、IncK和IncI1型。受试菌分属于种系发育的D群(7株)、B1群(6株)和A群(4株),未检出强致病力的B2群菌株。受试菌均含有fimH、traT和feoB毒力基因,同时毒力基因检测率较高的还有sit A、iut A、iucC、iroN和iss基因。结果表明,ISEcpl和IS903转座子、IncF在bla_(CTX-M-9)快速散播过程中发挥了重要的作用,克隆传播仅发挥了次要的作用;产CTX-M-9族鸡大肠杆菌含有较多的毒力基因,具有一定的致病力。 相似文献
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《科技视界》2017,(13)
9-5/8″技术套管固井传统做法是采用一维轴向顶替方式,存在水泥浆走高边,低边冲洗困难,顶替效率低,固井质量较差,定向井尤其明显,井筒完整性很难保障。为了解决此该问题,9-5/8″技术套管旋转固井工艺技术在涠洲某油田钻完井作业过程中被首次提出并成功实施,为中海油首次。本文主要从9-5/8″技术套管旋转固井工艺的原理、优点及限制条件等方面详细介绍,9-5/8″技术套管旋转固井是通过以下几个措施来实现的:选用高抗扭套管保证旋转情况下套管串的有效性,利用顶驱下套管工具(CRT)对套管串施加动力,通过软件模拟计算合理加装套管扶正器降低套管串摩阻。结果表面,9-5/8″技术套管旋转固井工艺技术能够改变环空流态,改善冲洗效果,提高顶替效率和固井质量,保障井筒完整性。 相似文献
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