过量表达CHIP蛋白抑制小鼠前成骨细胞分化和矿化

摘要 以MC3T3-E1细胞系为实验材料，体外转染pEFNeu-HA-CHIP质粒，Western blot检测CHIP蛋白表达，建成了稳定过表达CHIP 蛋白的MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系。然后用含10mM/ml甘油磷酸钠和50ug/ml抗坏血酸的α-MEM条件培养基诱导MC3T3-E1和MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系向成骨细胞定向分化，结果表明诱导期MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系中的ALP活性比MC3T3-E1细胞中的ALP活性低，ALP染色实验同时证实了这个结果；诱导培养18天以后，Von Kossa染色和茜素红染色结果表明MC3T3-E1/HA-CHIP细胞系中生成的磷酸钙比MC3T3-E1细胞系中生成的磷酸钙少。以上结果表明过表达CHIP蛋白抑制MC3T3-E1细胞的分化和矿化。     

一起幼鹅佝偻病的诊治

鹅的佝偻病多发于幼鹅，是由于钙、磷代谢障碍引起骨组织发育不良的一种非炎性疾病，维生素D缺乏在此病中也起重要作用，故也称钙磷及维生素D代谢障碍综合征。病理特征是成骨细胞钙化作用不足，持久性软骨肥大及骨骺增大。临床特征是脚部软弱无力，常蹲伏而不愿行走，喙和爪变得柔软而易弯曲，骨骼变形。笔者曾诊治过一起幼鹅佝偻病，经过临床观察、病理剖检和治疗措施，治愈了幼鹅佝偻病。现将情况报告如下：     

日粮钙水平对仔猪成骨细胞活性和胫骨性能的影响

【目的】研究日粮钙水平对仔猪血清碱性磷酸酶活性、骨钙素质量浓度、血清钙浓度及胫骨钙含量和密度的影响,为钙调控仔猪成骨细胞活性提供依据。【方法】采用单因子完全随机分组设计,将60头杜长大仔猪(体质量(21.8±2.1)kg)分成6个处理,每处理设10个重复,每重复1头猪。各处理分别饲喂钙水平为0.30%,0.45%,0.60%,0.75%,0.90%和1.05%的玉米-豆粕型日粮。预饲期为7d,正式试验期28d,并在正式试验的14和28d屠宰仔猪,测定其血清钙浓度、血清活性标志物碱性磷酸酶活性和骨钙素质量浓度及胫骨钙含量和密度,分析钙水平对仔猪成骨细胞活性和胫骨性能的影响。【结果】随着日粮钙水平的提高,血清碱性磷酸酶活性呈先减小后增大的趋势(P0.05),且在日粮钙水平为0.75%时出现最小值;血清骨钙素质量浓度呈先增大后减小的趋势(P0.05),且在钙水平为0.75%时达到最大(P0.05);日粮钙水平对血清钙浓度无显著影响(P0.05),但对胫骨钙含量、脱脂胫骨干质量、胫骨灰分含量、胫骨密度4项胫骨性能指标影响显著(P0.05),且在日粮钙水平为0.75%时,各项胫骨性能指标均达到最大。【结论】日粮钙水平为0.75%时,仔猪胫骨中成骨细胞的矿化作用最大,增殖活性最小。     

酶法制备大豆蛋白成骨活性肽

【目的】探究从大豆分离蛋白双酶分步酶解产物中分离促成骨细胞增殖肽的工艺,为大豆产品的开发提供参考。【方法】以促成骨细胞增殖活性作为测定指标,选用木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白（SPI）,采用MTT法检测不同浓度的木瓜蛋白酶酶解产物对成骨细胞的促增殖活性。采用pH-Stat法检测水解时间为1、2、3、4、5和6 h的木瓜蛋白酶酶解产物的水解度,并检测相应水解时间的酶解产物对成骨细胞的促增殖活性。然后分别采用截留分子量为30 kD和10 kD两种超滤膜对活性较高的酶解产物进行超滤,并测定各超滤组分对成骨细胞的促增殖活性。再将具有较高促成骨细胞增殖活性的超滤组分分别在0.5、1、1.5、2和2.5 h进行碱性蛋白酶酶解,并检测相应水解时间的酶解产物对成骨细胞的促增殖活性。然后选用交联葡聚糖（Sephadex G-15）对具有较高促成骨细胞增殖活性的酶解产物进行分离,并检测各分离组分对成骨细胞的促增殖活性。最后,对各分离组分进行氨基酸分析,并采用质谱（ESI-TOF MS/MS）对最高促成骨细胞增殖活性的分离组分进行结构鉴定,并筛选出具有较强促成骨细胞增殖的大豆活性肽。【结果】在浓度为200 μg·mL ^-1时,木瓜蛋白酶酶解物对成骨细胞的促增殖活性随着酶解时间的增加逐渐增强,当酶解时间为5 h时达到最高促增殖活性（（118.24±2.73）%）。木瓜蛋白酶酶解产物经超滤分离、碱性蛋白酶酶解和凝胶过滤色谱分离后,对各分离组分进行氨基酸分析并筛选得到对成骨细胞具有最强增殖活性的组分F3,该组分的成骨细胞增殖率为（125.80±2.94）%,且F3中丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等疏水性氨基酸以及芳香族氨基酸和必需氨基酸的含量明显高于其他组分。进一步通过质谱鉴定出F3主要由10个肽段组成。其中,DAMDGWFRL、GQTPLFPR、ADFYNPK、KDWYDIK的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸以及必需氨基酸占比较高。对上述4个肽段进行活性测定,发现GQTPLFPR的促成骨细胞增殖活性最强,在浓度为100 μmol·L^-1时,其成骨细胞增殖率为（129.11±3.12）%。【结论】采用双酶分步酶解结合超滤和凝胶过滤色谱等蛋白分离纯化技术,从大豆分离蛋白中分离纯化出了具有较强促成骨细胞增殖活性的多肽,为促成骨细胞增殖活性肽的制备和应用提供了技术参考。     

补骨脂水提液及补骨脂素对体外培养成骨细胞的影响

为了探讨补骨脂水提液及补骨脂素对体外培养成骨细胞的影响,采用MTT法、PNPP(对硝基苯磷酸二钠盐)法及流式细胞术,分别检测不同浓度的补骨脂水提液(10-4～101 mol·L-1)及补骨脂素(10-8～10-4mol·L-1)对体外培养小鼠成骨细胞增殖、分化及细胞周期的影响.结果表明,10、10-8 mg·ml1补骨脂水提液对成骨细胞有明显的促增殖作用;高浓度(10-4、10-5 mol·L-1)补骨脂素抑制细胞增殖,而低浓度(10-7、10-8mol·L-1)补骨脂素能够促进增殖;10-4、10-6 、10-8 mol·L-1补骨脂素均能使成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性明显上升;各浓度的补骨脂水提液及补骨脂素使细胞G1期百分比降低,而S期、G2期百分比显著增加.试验结果证实补骨脂水提液及补骨脂素具有植物雌激素样作用,可以促进成骨细胞增殖,促使细胞由G1期向S期、G2期转化;补骨脂素是促进成骨细胞分化的有效成分.     

1α,25-二羟维生素D_3对大鼠成骨细胞增殖分化及周期的影响

在SD大鼠成骨细胞(Osteoblast,OB)体外培养体系中添加不同浓度1α,25-二羟维生素D_3(0、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7) mol/L),作用24、48、72 h,测定OB增殖率、碱性磷酸酶(ALP)活性,作用48 h流式细胞仪测定OB周期.结果显示,10~(-9)mol/L 1α,25-二羟维生素D_3作用24、48、72 h均促进OB增殖(P<0.05或P<0.01),抑制ALP活性(P<0.01);10~(-8)、10~(-7)mol/L作用24、48 h,OB增殖率与对照组差异不显著(P>0.05),但24 h时ALP活性均明显升高(P<0.05或P<0.01),48 h则抑制了ALP活性并使OB滞留在G_2/M期(P<0.05或P<0.01);72 h时10~(-7) mol/L组OB增殖率极显著低于其余各组(P<0.01),并使ALP活性升高(P<0.01).表明低浓度1α,25-二羟维生素D_3能促进OB增殖,抑制其分化;高浓度1α,25-二羟维生素D_3能抑制OB增殖,促进其分化,并使细胞滞留在G_2/M期.     

科技动态

正H5N1亚型禽流感病毒对鹌鹑具有高度致死性中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的科研人员探讨了H5N1亚型禽流感病毒(AIV)对鹌鹑的致病性及其接触传播能力。研究选择2009~2012年分离的3株Clade 2.3.2病毒株DK/GD/1322/10、DK/GZ/4102/10、GCG/QH/1/09和1株Clade 7.2病毒株CK/NX/2/12,以105EID50的剂量,人工感染4周龄鹌鹑,并于感染后24 h放入同居鹌     

纳米磷酸三钙/明胶/鹿茸多肽复合材料的制备及对人成骨细胞增殖、分化及矿化的影响

探讨反相微乳液法制备的β-纳米磷酸三钙/明胶/鹿茸多肽复合材料(简称纳米复合材料)对人成骨细胞功能的影响.利用反相微乳液法制备纳米复合材料,扫描电镜观察其形态,EDX与SELDI-TOF-MS分析对复合材料进行表征.采用MTT比色法、茜素红染色法检测纳米复合材料对体外培养的人成骨细胞hFOB1.19的增殖、矿化结节形成的影响;采用全自动生化分析仪检测hFOB细胞碱性磷酸酶活性(ALP).结果表明该纳米复合材料可促进人成骨细胞增殖,提高ALP活性并增加矿化结节形成的数量,可促进人成骨细胞的增殖、分化成熟及矿化.     

鸡胚精原干细胞定向诱导分化为成骨细胞的初探

研究体外定向诱导鸡胚精原干细胞（Spermatogonial stem cells,SSCs）向成骨细胞分化的能力。采用地塞米松＋β-磷酸甘油钠＋维生素C组成的诱导液对鸡胚精原干细胞进行诱导,利用Von Kossa＇s法、改良的钙钴法及免疫组化I型胶原（CollagenⅠ）进行成骨细胞特性鉴定。结果表明：诱导后成骨细胞形成率达到82%,诱导后的细胞经Von Kossa＇s染色可见细胞间布满黑色颗粒,提示有矿化基质沉积;改良钙钴法碱性磷酸酶染色胞浆呈深棕色或深黑色,免疫组化法染色细胞呈阳性。因此可以得出：鸡精原干细胞（SSCs）具有向成骨细胞分化的能力。     

Cbfal对成骨细胞调控作用的研究进展

核心结合因子α1（Cbfal），是成骨细胞发生和分化的特异性转录因子。Cbfal／p56能激活T细胞特异性基因表达，Cbfal／1357的超表达能诱导多潜能间充质干细胞向成骨细胞表型分化，并激活骨钙蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白、骨唾液蛋白等成骨基因转录。Cbfal基因反义寡核苷酸则阻止OB分化和骨化形成，如果Cbfal基因缺失，将导致形成以破骨细胞、软骨细胞和软骨组织为主而缺乏成骨细胞的骨骼系统。骨形态发生蛋白、转移生长因子、肿瘤坏死因子α、成纤维细胞生长因子2、甲状旁腺激素、糖皮质激素地塞米松和1，25（OH）2D3等因子可上调或抑制Cbfal的表达，在骨的发育和组织钙化过程中起着重要的调节作用。