山羊卵泡发育相关基因的筛选及分析

【背景】山羊第一卵泡波中的优势卵泡（dominant follicles, DF）和从属卵泡（subordinate follicles, SF）是整个卵泡发育过程中最为关键的两个阶段。随着卵泡的进一步发育,最终DF可能发育成为成熟卵泡,直到排卵;SF将走向闭锁,其中颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的关键因素。然而目前对促进卵泡的优势化或导致其闭锁的分子机理尚不清楚。【目的】通过对山羊第一卵泡波中DF和SF颗粒细胞进行高通量测序,旨在筛选影响卵泡发育的关键基因,为深入探究卵泡发育的调控机制提供理论依据。【方法】选取10只1岁龄健康的贵州白山羊分别注射前列腺素F_2α,使其同期发情,此后每天用B超检测并记录卵泡的生长情况,发情3 d后,统一屠宰并采集第一卵泡波中DF (直径4.5—6 mm)与SF (直径3 —4.5 mm),分别分离其中的颗粒细胞,提取总RNA、构建文库后通过Illumina Hiseq 2500平台进行测序。利用FastQC对测序产出raw reads进行质量评估并经过过滤后,获得品质较高的clean reads;使用Trinity对得到的clean reads进行重新组装,从而获得unigenes;使用CLC Genomics Workbench将unigenes与山羊RefSeq数据库进行比对获得mRNA;使用DESeq2 软件对获得的mRNA进行差异表达分析;分别采用goseq和kobas软件对得到的差异表达基因进行GO分析及KEGG信号通路分析;最终通过qRT-PCR对筛选出的可能影响卵泡发育的关键基因进行验证。【结果】分别对测序得到的raw reads进行过滤后,在DF颗粒细胞中获得43 217 934条clean reads,占raw reads的比例为95.19%;SF颗粒细胞中获得40 766 348条clean reads,占raw reads的比例为95.35%。将得到的unigenes与山羊的RefSeq 数据库进行比对后,共得到33 896条带有注释的转录本,再通过设定FPKM>1, q value<0.05,共在两种卵泡颗粒细胞中获得13 644个基因。设定参数：FPKM≥1,SF-FPKM/DF-FPKM>1,P<0.05,获得695个差异表达mRNA,其中233个在SF颗粒细胞中表达显著上调,462个表达显著下调;对所获得695个差异表达mRNA进行GO功能富集分析,共分为三大类42组：其中生物学过程占47.6%,细胞组分占47.6%,分子功能占4.8%;KEGG信号通路分析,发现20条通路,其中与核糖体通路相关的基因富集最为显著。通过在Genecard中进行功能分析后,筛选6个可能与山羊卵泡发育密切相关的基因,其中PRLR、PTX3、RGN在SF颗粒细胞中表现为上调;DKK3、ALDH1A2、RARRES1则表现为下调。qRT-PCR显示PRLR、RGN、DKK3、ALDH1A2、RARRES1的表达趋势与高通量测序结果一致,且RGN在从属卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于优势卵泡（P<0.01）;DKK3、ALDH1A2、RARRES1在优势卵泡颗粒细胞中的表达量极显著地高于从属卵泡（P<0.01）。【结论】DKK3、ALDH1A2、RARRES1和RGN在优势卵泡和从属卵泡中表达量存在极显著差异,推测在山羊卵泡发育过程中可能促进卵泡的优势化或导致闭锁,对深入探究卵泡发育的调控机制具有重要意义。     

辽河干流河岸带植物及微生物多样性研究

为明确辽河保护区河岸带生物多样性恢复现状以促进河岸带生态系统的健康管理,本研究通过植被现场调查和土壤微生物高通量测序分析,对辽河干流23个采样点的植物多样性和微生物多样性进行测定,结果表明:辽河干流23个采样点的植被Shannon-Weiner多样性指数平均为1.227,平均植被覆盖率达到74.19%;河岸带土壤微生物Shannon-Weiner多样性指数平均为9.55;其优势度大于1%的细菌属于11个门、32个纲、40个属;人类活动干扰、放牧情况以及土地利用类型是影响河岸带植物和微生物多样性的关键因子。目前辽河保护区河岸带生物多样性恢复状态较好,但日渐增多的人类活动对河岸带生物多样性的恢复产生不利影响,因此建议尽量减少封育区内的人类活动、放牧情况等,以加快辽河保护区河岸带植物及土壤微生物多样性的恢复进程。     

南京地区斑点叉尾鮰养殖池塘水体微生物群落结构研究

微生物群落在水产养殖中起着重要作用,深入了解微生物群落组成及其构建机制对了解池塘生态功能具有重要意义。本研究采用高通量测序技术对南京地区斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)养殖池塘水体中细菌群落结构特征进行了分析。结果显示,斑点叉尾鮰养殖池塘水体细菌群落结构呈现出明显的季节性变化,整个年度水体细菌群落呈现出连续的演替特征,冬季与春季、夏季与秋季的细菌群落结构较为相似。优势菌群主要为蓝藻门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)。环境因子中,总溶解性悬浮物(TDS)、水温(Temp)、酸碱度(pH)、亚硝酸盐(NO_2~--N)和总有机碳(TOC)与斑点叉尾鮰养殖池塘水体细菌群落结构有显著相关(P0.05),对细菌群落结构的塑造影响也最大(r~20.6)。     

6 个不同品种荔枝果肉内生细菌群落多样性的高通量测序分析

【目的】内生菌在植物生长发育中发挥重要作用,分析不同品种荔枝果肉内生细菌群落结构及多样性,挖掘和利用潜在荔枝内生菌种资源,为进一步研究荔枝与内生菌互作关系提供参考依据。【方法】以 6 个不同品种荔枝的果肉组织为材料,PCR 扩增 16S rDNA 的 V3~V4 区,利用 MiSeq 高通量测序技术分析果肉组织内生细菌在门、科、属和种分类水平上的群落组成及优势菌群,结合 Alpha 多样性分析评估内生细菌群落多样性。【结果】对 6 个品种荔枝果肉内生细菌 16S rDNA 的 V3~V4 区进行扩增,共获得 2 139 086 条序列,其平均长度为 376 bp。不同品种荔枝果肉内生细菌群落在相对丰度和多样性上无显著差异。在门分类水平,变形菌门为主要优势细菌门类,其次为放线菌门。在科、属和种分类水平上,不同品种荔枝内生菌群落结构相似,但相对丰度占比不同。差异菌群分析结果显示,假单胞菌属（Pseudomonas）、果胶杆菌属（Pectobacterium）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）和迪基氏菌属（Dickeya) 在优良品种‘鹅蛋荔’‘糯米糍’和‘观音绿’中显著富集,根瘤菌属（Bradyrhizobium）和变形菌属（Snodgrassella）只在‘鹅蛋荔’中富集。根据菌群相对丰度进行聚类分析,‘观音绿’‘糯米糍’和‘鹅蛋荔’的相似性更高。Alpha 多样性分析结果表明,6 种荔枝果肉内生菌群仅在丰度和多样性上存在差异,但未达到显著水平。【结论】该研究首次分析了 6 个不同品种荔枝果肉内生细菌的群落结构,并在优良荔枝品种中发现特有的微 生物类群富集现象,可为后续提升荔枝品质、开发利用内生菌提供理论依据和重要参考。     

铺地木蓝对肇庆地区柑橘园土壤养分及细菌群落的影响

【目的】探究铺地木蓝在柑橘果园种植 1 年后对杂草、0~20 cm 土层土壤养分含量和土壤细菌多样性的影响。【方法】设置自然生草（CK1）、土壤覆盖遮草布（PD1）、土壤覆盖银黑地膜 + 种植铺地木蓝（PD2）、种植铺地木蓝（PD3）4 个处理,1 年后调查杂草种类、测定土壤理化性质（pH、有机质、全氮、碱解氮、全磷、速效磷、全钾和速效钾）和土壤细菌群落情况。【结果】 PD2 处理土壤全氮（0.86 mg/g）、全磷（0.78 g/kg）、速效磷（23.84 mg/kg ）、全钾（11.91 g/kg）、有机质（34.82 g/kg）含量最高;PD2 处理土壤全氮和碱解氮含量比 PD1处理的分别增加了 0.37、27.43 mg/kg,PD1 处理土壤全磷含量最低（0.41 g/kg）,PD3 处理速效磷（10.67 mg/kg）和有机质（25.99 g/kg）含量最低;PD1~PD3 处理的土壤全钾含量均大于 CK1 处理,速效钾含量则相反;杂草调查结果表明 PD1、PD2 处理均可很好地抑制杂草的生长。与 CK1 相比,PD1~PD3 处理均可降低土壤细菌群落多样性,但不影响细菌群落分布均匀性。PD2 和 PD3 处理的土壤细菌群落结构和丰度较相似,表现为变形菌门（Proteobacteria）相对丰度降低,绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、罗库菌门（Rokubacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等有益细菌的相对丰度增加;其中 PD2 处理的优势菌属为 MND1（3.47%）、Sh765B-TzT-35（4.37%）,PD3 处理的优势菌属为 MND1（4.29%）。从 PD1 处理土壤中检测到视为土壤环境恶化的标志类群异常球菌 - 栖热菌门（5.10%）。【结论】柑橘果园行间道覆盖地膜后再种植铺地木蓝的综合表现最好,可以增加土壤养分和土壤中有益细菌群落的相对丰度。     

基于高通量测序技术分析石蝉草内生细菌多样性

以石蝉草根、茎、叶为材料,采用Illumina Mi Seq高通量测序技术研究石蝉草内生细菌多样性。结果表明,根、茎、叶样品共测得167个OTUs,归属于11个门,分别为变形菌门、Ignavibacteriae、芽单胞菌门、梭杆菌门、厚壁菌门、异常球菌-栖热菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门,各样品的菌群组成和多样性虽有差异,但以变形菌门为优势菌群,约占62.48%~93.24%。在各样品菌群丰度最高的10个OTUs中,叶部优势群落芽孢杆菌属、根部特有群落粘球菌目与石蝉草中具有抗炎、抗肿瘤活性的物质存在潜在相关性。     

东北黑土nirS型反硝化细菌群落和网络结构对长期施用化肥的响应

【目的】探明长期施用氮磷钾化肥对东北黑土农田土壤nirS型反硝化细菌群落和网络结构的影响,为更加合理的肥料配施提供理论依据。【方法】基于农业农村部黑龙江耕地保育与农业环境科学观测实验站平台,选取不施肥(NoF)、氮肥(N)、磷肥(P)、钾肥(K)、氮钾肥(NK)、氮磷肥(NP)、磷钾肥(PK)、氮磷钾肥(NPK)8个施肥处理,借助荧光定量PCR、Illumina MiSeq高通量测序和分子生态网络技术,分析东北黑土nirS型反硝化细菌丰度、群落及网络结构,及影响反硝化细菌群落变异的主要环境因子。【结果】1)长期施用氮肥均在显著增加nirS基因拷贝数的同时,降低了nirS型反硝化细菌的群落多样性,而磷、钾肥对其影响并不显著。2)Proteobacteria是所有处理中的优势反硝化细菌门,相对丰度为16.96%~27.34%,且氮肥的施用促进了隶属于该菌门中Bradyrhizobium的生长。3)PCoA分析结果显示,8个施肥处理nirS型反硝化细菌群落主要分成施氮肥和不施氮肥两组,说明长期氮肥的施用显著改变了东北黑土反硝化细菌的群落结构。结合Mantel test的结果可知,土壤pH是影响nirS型反硝化细菌群落改变的主要因素。4)分别构建施氮肥和不施氮肥的反硝化细菌分子生态网络,发现施氮肥和不施氮肥网络结构存在很大差异,长期施用氮肥明显简化了nirS型反硝化细菌的网络结构,同时使其网络结构稳定性降低,易受外界环境扰动。【结论】尽管施用化学氮肥有利于土壤养分的增加,但其土壤nirS型反硝化细菌群落及网络结构发生了较大改变,而磷、钾肥的施用对反硝化细菌群落无显著影响。本试验结果为进一步研究东北黑土区农田土壤反硝化微生物对不同施肥管理的响应机制提供了重要科学依据。     

长期咸水滴灌对棉田土壤细菌和真菌群落结构的影响

【目的】研究长期咸水灌溉对棉田土壤理化性质、细菌和真菌群落结构多样性的影响。【方法】设3个灌溉水盐度处理为0.35、4.61和8.04 dS/m,分别代表淡水、微咸水、咸水3种灌溉水质,采用高通量测序法测定土壤中细菌和真菌群落结构多样性。【结果】与淡水灌溉相比,微咸水和咸水灌溉显著提高了土壤盐分和土壤容重,但降低了土壤pH、有机质和全氮含量。微咸水和咸水灌溉显著增加细菌OTUs,而咸水灌溉显著降低真菌OTUs。咸水灌溉显著增加细菌Chao1和ACE指数,降低Shannon指数,降低真菌Chao1和ACE指数,增加Simpson指数。微咸水和咸水灌溉显著降低细菌RB41、H16、Haliangium、硝化螺旋菌属、溶杆菌属、苔藓杆菌属、酸杆菌属和真菌被孢霉属、粉褶菌属、Tetracladium的相对丰度,但显著增加细菌鞘脂单胞菌属、芽单胞菌属、Gaiella、Ilumatobacter、Solirubrobacter、Nocardioides和真菌弯孢菌属、球腔菌属的相对丰度。随着灌溉水盐度的增加,细菌群落潜在生物标志物的数量逐渐减少,为4个、2个和1个,真菌群落潜在生物标志物数量在微咸...     

不同年限稻鸭共作对水体藻类群落结构的影响

为探究不同规模、不同年限稻鸭共作系统水体藻类群落组成及多样性的差异,通过设置不同年限(4、20 a)和不同规模(0.067、0.200、0.333 hm~2)稻鸭共作田,利用高通量测序等手段,分析稻鸭共作田水体藻类多样性及群落结构的变化规律。结果表明:稻鸭共作田水体藻类的丰富度指数较非稻鸭共作田高,长期稻鸭共作田水体藻类Ace丰富度指数较短期共作田高,物种数增多;稻鸭共作田与非稻鸭共作田水体藻类优势种均为裸藻、绿藻、蓝藻,但稻鸭共作田绿藻、蓝藻的相对丰度高于非稻鸭共作田,另外稻鸭共作田规模大小影响蓝藻的相对丰度,规模越大蓝藻相对丰度越低;稻鸭共作田藻类多样性指数比非稻鸭共作田高,水体藻类群落结构差异较大,稻鸭共作系统的水体藻类群落结构表现出一定的相似性。冗余分析表明,对于稻鸭共作后期而言,影响非稻鸭共作田水体藻类群落结构的主要环境因子是溶解氧,而影响稻鸭共作水体藻类群落结构的环境因子是可溶性钾和pH。研究表明,长期稻鸭共作系统提高水体藻类多样性,改变藻类群落组成,从而影响农田水体生态环境。