家鸡染色体研究进展

近年来,由于现代分子细胞遗传学技术,尤其是荧光原位杂交(FISH)技术的出现,使家鸡的染色体研究又进入了一个新的高潮.作者从家鸡染色体核型研究简史、显带研究及其现代分子细胞遗传学研究3个方面对家鸡染色体研究进展作一概述,旨在对其有一较系统全面的了解,以促进其进一步研究,并为其它禽类的染色体研究提供参考.     

融合表达淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒和卵清白蛋白CD8+T细胞表位的减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

依据淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)主要保护性抗原CD8 T细胞表位VRRPQASGVYMGNLTAQ和卵清白蛋白(OVA)CD8 T细胞表位SIINFEKL,设计、合成两条编码LCMV和OVA CD8 T细胞表位的寡核苷酸片段,经退火后,克隆入绿色荧光蛋白表达质粒pYAGFP,经PCR扩增和序列测定分析,证实成功构建T细胞表位与绿色荧光蛋白融合表达的重组质粒pYAGFPL-O,将此重组质粒pYAGFPL-O转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,获得重组沙门氏菌X4550(pYAGFPL-O).用SDS-PAGE电泳测得重组菌表达的融合蛋白约为30kD.同时,荧光显微镜下观察到X4550(pYAGFPL-O)发出黄绿色荧光.这些结果表明LCMV和OVA T细胞表位已成功表达.重组菌X4550(pYAGFPL-O)的获得为研究沙门氏菌载体携带外源抗原的T细胞应答规律及调控机理打下了重要基础.     

实时荧光定量PCR构建绵羊PrP基因标准品质粒和标准曲线

羊痒病是一种传染性的致死性神经退行性疾病,常引起绵羊和山羊发病,该病在欧洲流行了大约250年,但是它的流行病学和传播机制还不是很清楚.正常的朊蛋白（PrPc）不能引起神经退行性病变,虽然目前已经对许多组织的PrP mRNA进行了检测,但是对它的生物学功能还知之甚少,对PrP基因表达的机制尚不清楚.研究显示,不同组织来源的细胞中朊蛋白的表达程度差异很大,主要出现于神经细胞中.PrPc在细胞中的高水平表达可促使PrPc向PrPsc转变,目前的研究中,对绵羊PrP mRNA的转录机制尚未阐释清楚.因此,对绵羊外周和中枢系统PrP mRNA的表达进行定量,有助于探讨各组织器官中的PrP在羊痒病的发生过程中的作用.     

副溶血弧菌和霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重荧光定量PCR方法。根据副溶血弧菌toxR基因和霍乱弧菌ompW基因设计特异性引物与TaqMan探针。toxR和ompW探针5'端分别标记FAM、CY5荧光报告基团,3'端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示:该方法的副溶血弧菌和霍乱弧菌最低检测限均达到10 CFU/m L,灵敏度高;特异性试验表明这两种细菌与其他病原菌(大肠杆菌O157、沙门氏菌、拟态弧菌、创伤弧菌)无交叉反应;批间和批内重复性实验表明变异系数均小于1.5%,说明重复性好。采用人工染菌虾肉样品,副溶血弧菌和霍乱弧菌的最低检测限分别为100 CFU/m L和50 CFU/m L,人工染菌贝类样品的最低检测限分别为50 CFU/m L和50 CFU/m L。两种细菌在虾肉中富集2 h后的最低检出限均为1 CFU/m L。结论:本研究所建立的双重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,包括DNA提取的整个检测过程可在1至3 h内完成,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效手段。     

两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对巨噬细胞炎性细胞因子mRNA表达的影响

丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫入侵宿主的过程中发挥着关键作用,能够参与到入侵宿主、免疫逃避、炎症反应、凝血系统和细胞迁徙等过程。为了探讨两种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Ts Ad SPI和Ts Ka SPI)对巨噬细胞所分泌炎性细胞因子的调节作用,应用实时荧光定量PCR技术对两种SPIs分别处理的小鼠巨噬细胞进行TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10、TGF-βmRNA表达水平的检测。结果显示,Ts Ad SPI和Ts Ka SPI均可不同程度的抑制LPS活化的小鼠巨噬细胞促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12 mRNA的表达水平。并且两种SPI均可不同程度的促进巨噬细胞抗炎性细胞因子IL-10和TGF-β的表达。表明这两种旋毛虫SPI可通过调节宿主巨噬细胞影响入侵时宿主的免疫应答。     

谷胱甘肽硫转移酶参与家蚕氟化物耐受性形成的研究

利用对氟化物高度敏感的家蚕品种733新和高度耐受性品种T6构建耐氟近等基因系,对回交15代的近等基因系群体从幼虫2龄眠起开始至4龄第3天连续添食200 mg/kg Na F溶液浸渍的桑叶,调查蚕体重要代谢酶类谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因表达和酶活性的变化。解剖获取4龄3 d幼虫中肠组织进行双向电泳分析的结果显示,近等基因系群体中耐氟个体中肠的GST表达量比敏感个体明显上调。进一步利用实时荧光定量PCR检测GST基因在耐氟个体与敏感个体中肠、血淋巴、脂肪体和马氏管中的相对表达量,并对5龄1~6 d幼虫中肠、血淋巴中的GST酶活力进行测定。结果表明,家蚕对氟化物的抵抗力可能与体内GST酶活力的强弱有关,由于受氟化物刺激的诱导,可能导致GST基因表达水平发生了变化。研究结果为进一步探索家蚕耐氟机制提供了有用信息。     

紫花苜蓿9个盐响应相关基因表达模式

紫花苜蓿(Medicago sativa)是世界上种植面积最大、应用最广泛的豆科牧草。由于其耐盐性中等,其在我国北方地区的产量和种植受到土壤盐渍化的限制。因此提高紫花苜蓿的耐盐性具有重要的科学和生产意义。为此,以龙牧801紫花苜蓿(M.sativa‘Longmu 801’)为试验材料,采用实时荧光定量PCR技术分析了不同浓度NaCl胁迫下9个盐胁迫蛋白质组筛选出的盐响应相关基因的表达模式。结果显示,处理时间和处理浓度对9个基因的相对表达量均有显著性影响,表明这9个基因均在紫花苜蓿盐胁迫应答中发挥着一定作用。处理1h时,G6PI、ABP19a、Trx-h1、PR bet 1、FBPA、6PGDH和ALDH这7个基因的相对表达量在不同NaCl胁迫浓度处理的紫花苜蓿中均显著上调,RRM和GDPD在NaCl处理2h后开始上调。除G6PI基因,其他8个基因在0.4%NaCl处理下相对表达量显著高于0.2%和0.8%NaCl处理。这些基因参与糖代谢、信号转导和胁迫响应。以上结果表明,紫花苜蓿的耐盐性极其复杂,涉及到多基因的表达和代谢通路的调控。研究结果有助于全面研究并了解紫花苜蓿的盐响应相关基因的表达模式,促进紫花苜蓿耐盐分子育种。     

新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒,感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状,和猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)临床症状极其类似,且临床上混合感染病例较多,单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病,因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoV M基因和PEDV ORF3基因特异性序列设计引物,扩增相应的基因片段,克隆构建重组质粒pMD-18T-PDCoV-M与pMD-18T-PEDV-ORF3,测序验证后,分别以此重组质粒为标准品,建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化,同时对所建立的双重荧光RT-PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示,该试验成功建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR方法,最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28.6拷贝/μL和99.6拷贝/μL的质粒浓度,显示出较好的敏感性;在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性;特异性试验表明,该方法仅能检测出PEDV和PDCoV,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RT-PCR方法以及单重荧光定量RT-PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PDCoV检测,结果显示,PDCoV阳性样品41份,阳性率为20.7%;PEDV阳性样品59份,阳性率为29.8%;同时感染这2种病毒的样品17份,阳性率为8.6%。与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样,符合率100.0%。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT-PCR方法,能同时准确地检测PDCoV和PEDV,这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。     

嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立荧光定量PCR方法检测嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum),针对GenBank A.phagocytophilum 16S rRNA基因保守序列(JN558815),设计1对引物1-25F/183-205R。以已知引物EE1/EE2和该引物进行巢式PCR扩增出预期大小片段(205bp),构建含有16S rRNA基因的重组质粒,以质粒为模板构建了标准曲线。以1-25F/183-205R为荧光定量PCR引物,建立A.phagocytophilum荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样本检测。结果表明,该方法在6.4×10~3~6.4×10~8 copies/μL相关系数为0.99,显示出良好的线性关系;所建方法能特异地检出A.phagocytophilum,对绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫基因组DNA和灭菌双蒸水均无交叉反应;可检测到6.4×10~2 copies/μL的标准质粒DNA,比常规PCR敏感性高100倍;批内及批间变异系数均低于2.0%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法对30份羊血液临床样品检出率比巢式PCR高16.67%。该研究为A.phagocytophilum临床检测和定量分析病原感染程度奠定理论基础。     

猪细小病毒6型SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

采用PCR方法扩增PPV6保守区域基因252bp,将其克隆到pClon007载体,构建重组质粒作为标准阳性质粒。以质粒模板建立PPV6的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,并进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果表明,重组质粒特异性好;建立的real-time PCR方法Ct值与标准品模板在8.80×109~8.80×101 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.993,斜率为-4.320。该方法检测灵敏度可达8.80×101 copies/μL。该方法对JEV、PRV、PRRSV、PCV2、FMDV等猪常见病原检测均无特异性扩增;对临床样品的检测结果表明,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为40.63%。本试验成功建立了PPV6SYBR Green I real-time PCR检测方法,可实现对PPV6快速灵敏的诊断。