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71.
结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达 总被引:3,自引:0,他引:3
以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础 相似文献
72.
鸡痘病毒通用高效表达载体的构建及其初步应用 总被引:4,自引:0,他引:4
利用分子克隆技术对本室构建的高效鸡痘病毒表达载体 p1 1 S进行改造 ,在其人工合成禽痘病毒 ( FPV)强启动子 Ps的下游引入含 7个单一酶切位点的多克隆位点 ( MCS) ,构建了便于外源基因插入的通用性更强的高效单表达载体 p N1 1 S。然后将 FPV早晚期启动子 PE/ L 及其启动的鹅源新城疫病毒 NDV ZJ1株的 F基因一并插入 p N1 1 S中 ,使PE/ L 与 Ps反向串联 ,从而构建出 1个含 NDV ZJ1株 F基因的重组 FPV高效双表达载体 p N1 1 SEF,其 MCS可以用于插入其他外源基因。在此基础上 ,将 NDV ZJ1株的 HN基因插入 p N1 1 SEF的 Ps启动子下游的 MCS中 ,构建了共表达 NDV ZJ1株 F和 HN基因的重组 FPV双表达载体 p N1 1 SEFHN。将 p H1 1 SEFHN质粒 DNA与 FPV2 82 E4株共转染 CEF,得到共表达 NDV ZJ1株和 HN基因的重组 FPV,间接免疫荧光实验初步证明外源基因得到了较好的表达。表明所构建的通用高效 FPV表达载体有利于高效基因工程活载体疫苗的研制 ,具有广阔的应用前景 相似文献
73.
从鼠的肝脏组织中提取总 RNA,采用 RT- PCR获得了鼠层粘蛋白 ( laminin)α5链的 E3 ( L G4 - 5)、L G4 和 L G5等 3个基因片段 ,与 NCBI数据库参考序列相比 ,同源性在 99%以上。将 E3 ( L G4 ,5)、L G4 和 L G5定向克隆到原核高效表达载体 Pet- 2 8a中 ,构建 Pet- 2 8a- E3 、Pet- 2 8a- L G4 、Pet- 2 8a- L G5等 3个原核表达质粒。将表达质粒转化表达受体菌 BL2 1中 ,IPTG诱导表达。收集菌液进行 SDS- PAGE电泳、Western- blotting分析 ,结果显示 ,这 3段基因在原核细胞中成功表达 ,薄层扫描显示表达蛋白占细胞总蛋白的 2 0 %以上。大量提取包涵体 ,纯化后免疫家兔 ,8周后得多克隆抗体 ,间接 EL ISA在抗体稀释到 1∶ 1 2 80 0时仍为阳性 相似文献
74.
75.
通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF3扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF3(deleting ORF3)。将dORF3克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2,在E.coli BL21细胞中成功表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组蛋白GST-dORF3,表达产物以包涵体的形式存在,表达量为30.6%,Western-Blot结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRS病毒次要结构蛋白GP3的免疫特性和功能奠定了基础。 相似文献
76.
77.
将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应. 相似文献
78.
鸡新城疫云南分离株HN基因序列测定和分析 总被引:3,自引:0,他引:3
用RT—PCR法对分离自云南省的2株鸡新城疫病毒(编号YN—C1、YN—C2)进行HN基因的扩增和克隆.并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明:2毒株HN基因开放性阅读框架(ORF)均为l716nt;二者之间的核苷酸同源性为95.3%,氨基酸同源性为95.8%;YN—C1毒株与参考毒株GD/1/98/Go核苷酸、氨基酸同源性均最高,分别为97.9%和97.6%;YN—C2毒株与参考毒株JS/5/01/Go核苷酸同源性最高为98.5%,而与参考毒株JS/3/98/Go氨基酸同源性最高为98.1%。 相似文献
79.
用RT-PCR技术对猪瘟兔化弱毒C株、石门强毒株(Shimen)、近期地方流行的属于第1群毒株的新疆毒株(XJ)和第2群代表毒株甘肃临洮(LT)株E2基因的主要抗原区进行扩增,均得到约561bp的基因片段;经克隆测序及序列分析,该基因编码187个氨基酸残基,预计蛋白分子质量为21.7ku。将这4个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中,阅读框是正确的,从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用异丙基硫代-β-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,对表达的蛋白用SDSPAGE电泳、免疫印迹和薄层凝胶扫描分析。结果表明,E2基因的主要抗原区可以在大肠埃希氏菌中表达,表达的蛋白多以包涵体形式存在,表达产物的分子质量约为50.0ku,与理论推测的分子质量一致;薄层凝胶扫描分析表明。表达蛋白约占菌体蛋白总量的20.1%;免疫印迹结果证明,表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别。 相似文献
80.
根据环形泰勒虫TaA1272-1株裂殖体表面抗原(TaSP)基因的序列设计了1对引物,用PCR扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段(SBxp)。将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上,转化入大肠埃希氏菌JM109中进行克隆。随后将重组质粒pGEM-SBxp和表达载体pGEX-4T-1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后,将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体pGEX-4T-1-SBxp,并将其转化到BL21宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后,阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测。结果,SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达,其表达产物为分子质量43ku的融合蛋白,该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。 相似文献