三疣梭子蟹14-3-3基因的克隆及其在低盐和病原胁迫后的表达分析

本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)14-3-3基因(Pt14-3-3)。Pt14-3-3基因cDNA序列全长为2510 bp,包含开放阅读框741 bp,编码由247个氨基酸组成的蛋白,分子量为27.98 kDa。序列比对结果显示,Pt14-3-3基因与中华绒螯蟹14-3-3基因同源性最高(100%)。系统进化树分析表明,Pt14-3-3氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)紧密聚为一支。组织表达分析显示,Pt14-3-3基因在肝胰腺、肌肉、鳃、心脏、眼柄、血淋巴中均有表达,其中,在肝胰腺中的表达量最高。低盐胁迫后,Pt14-3-3基因在鳃和肝胰腺中的表达量分别于48 h和12 h显著上调并达到最大值,分别为对照组的1.34倍(P<0.05)和7.54倍(P<0.05)。人工感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和白斑综合征病毒(WSSV)后,Pt14-3-3基因在肝胰腺和血细胞中整体均呈显著上调表达,最高上调17.52倍(P<0.05)。本研究结果表明,Pt14-3-3基因可能在三疣梭子蟹低盐适应和免疫反应中发挥重要作用。     

口服特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾抗WSSV感染的免疫保护效果

为探讨特异性卵黄抗体对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)抗白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的免疫保护机制及效果,本研究以添加不同剂量WSSV卵黄抗体制剂(0、0.2%和0.5%)的饲料投喂凡纳滨对虾幼虾,免疫28 d后使用WSSV进行人工感染,测定感染对虾的肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,以及感染后14 d内对虾的存活率。结果显示,WSSV感染3 d后,与未添加卵黄抗体制剂的对照组相比,0.2%免疫组对虾肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)活力显著升高,酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活力显著降低,热休克蛋白70基因(Hsp70)表达水平显著升高,凝集素基因(lectin)和β-1,3-葡聚糖结合蛋白–脂蛋白基因(β-GBP-HDL)表达水平显著降低;0.5%免疫组对虾肝胰腺的SOD活力显著升高,ACP和AKP活力显著降低,Hsp70基因表达水平显著升高,β-GBP-HDL基因表达水平显著降低。人工感染实验结果显示,WSSV感染14 d后,0.2%和0.5%免疫组对虾的存活率分别为48.89%和87.78%,均显著高于对照组(存活率为0),且0.5%免疫组对虾存活率显著高于0.2%免疫组。特异性卵黄抗体制剂能在一定程度上改变发病的进程,延迟对虾的发病和死亡时间,提高同期存活率。研究表明,口服特异性卵黄抗体制剂可以调节对虾肝胰腺免疫酶活力和免疫基因表达水平,显著提高凡纳滨对虾抗WSSV感染的能力。本研究为卵黄抗体抗WSSV感染机制的研究提供了参考,也为在生产上使用卵黄抗体防控WSSV感染提供了科学依据。     

基于碳、氮稳定同位素研究黄海及东海北部主要鱼类的营养级和食性

本研究通过对2011~2014年间在黄海及东海北部采集的36种海洋鱼类进行碳、氮稳定同位素测定,利用碳稳定同位素比值(δ¹³C)计算底层饵料贡献比(Bp)来确定鱼类的食性,利用氮稳定同位素比值(δ¹⁵N)计算其营养级(TL)。结果显示,这36种鱼类的营养级范围为2.75~4.34,平均值为3.47。其中,4种为完全浮游生物食性,8种为底栖生物食性,完全底栖生物食性为12种,混合食性为12种。中(TL=3.5~4)、低(TL<3.5)营养级的种类占大多数(91.67%),而高营养级(TL>4)种类较少,仅为3种,且全部为混合食性。营养级的研究结果与1986、1992和2004年的研究对比发现,个别种类发生了改变。如蓝点马鲛(Sconberonorus niphonius)营养级有不同程度的下降;而黄鲫(Setipinna t)aty却有不同程度的上升。食性的研究结果与2004、2009和2011年的研究对比发现,有些种类食性发生了较大变化,如白姑鱼(Argyrosomus argentatus);有些种类食性几乎没有变化,如小黄鱼(Larimichthys polyactis)。     

长牡蛎食物组成的高通量测序分析

为了更加细致地甄别滤食性贝类的食物组成,于2019年8月,以北方规模化典型养殖海湾——桑沟湾养殖的长牡蛎(Crassostrea gigas)为研究对象,运用Illumina高通量测序技术对长牡蛎的胃含物及所处养殖水体中的真核生物进行分析研究。结果显示,扩增18S rDNA V4区平均得到111,359个有效序列短片段,在97%相似性水平上划分OTUs (operational taxonomic units),聚类后得到239个类别。其中,长牡蛎胃含物中的真核生物分属于34个门,绿藻门(Chlorophyta)、甲藻门(Pyrrophyta)、链形植物(Streptophyta)、硅藻门(Bacillariophyta)和原生动物(Protozoa)等为主要类群。所处养殖水体中的真核生物分属于37个门,绿藻门、脊索动物门(Chordata)、节肢动物门(Arthropoda)、甲藻门和硅藻门等为主要类群。结果表明,浮游植物是长牡蛎的主要食物来源,链型植物和原生动物也有一定的贡献,分别占总食物贡献量的10.43%和4.11%。研究结果为深入认识滤食性贝类的摄食生态学及其在养殖生态系统物质循环和能量流动中发挥的作用提供了数据支撑。     

虾类行动障碍野田村病毒(MDNV) TaqMan RT-PCR检测方法的建立与应用

基于虾类行动障碍野田村病毒(movement disorder nodavirus, MDNV)的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因设计寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的pMD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过优化反应体系和反应程序,建立了MDNV的TaqMan RT-PCR检测方法。优化后的反应组分：20.0 μL TaqMan RT-PCR反应液预混液中包含11.0 μL一步法RT-PCR缓冲液、0.8 μL酶混合物、0.3 μmol/L正向引物、0.3 μmol/L反向引物、0.4 μmol/L探针、1.0 μL模板和5.2 μL RNA-free H2O;优化后的反应程序：54.5℃ 15 min,95℃ 1 min;45个热循环扩增(95℃ 10 s,60.3℃ 30 s)。本研究所建立的方法能实现对MDNV的特异性检测,在1.4×1010~1.4×101 copies/μL标准质粒浓度范围内,起始模板浓度对数值与反应循环数间呈良好的线性关系;该方法最低可检测5.5×101拷贝的RNA标准品或1.4×101拷贝的pMD18-MDNV标准质粒。分析结果还显示,该检测方法批内Ct值和批间Ct值的变异系数(CV)分别小于1.27%和1.83%,具有良好的重复性和稳定性。利用该方法对2019年采自我国部分省市的样品进行检测发现,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中MDNV的阳性检出率为23.5% (16/68)。本研究建立的MDNV TaqMan RT-PCR方法具有特异性、快速和灵敏等特点,可为对虾养殖实践中MDNV的定性、定量检测与监测以及有效防控提供技术支持。     

四种不同引进群体的凡纳滨对虾种虾形态差异性分析

种虾资源的好坏影响着整个凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)产业的发展,从国外引进不同的种虾群体可以在一定程度改善我国的种虾资源。本研究以凡纳滨对虾种虾(所选种虾均为雌虾,在12~15月龄之间)为研究对象,运用聚类分析、主成分分析和判别分析等方法对4种不同来源的引进群体(PRIMO群体、SIS群体、厄瓜多尔群体和API群体)进行形态差异比较分析。结果显示,各性状的变异系数除了体质量外,其他均低于15.000%。单因素方差分析结果显示,在10个性状的比例参数中,头胸甲宽/头胸甲长和腹部宽/腹部长在4个种虾群体中无显著差异。聚类分析结果显示,PRIMO与SIS群体形态差异最小,与厄瓜多尔和API群体的趋异程度逐渐增加。主成分分析构建了4个主成分,累积贡献率为88.861%,其中,主成分1、2、3和4的贡献率分别为32.606%、23.982%、17.569%和14.704%。判别分析建立了4种不同来源的引进群体的判别函数,判别准确率P1为33.3%~67.1%,P2为30.8%~69.5%,综合判别准确率为52.1%。4个凡纳滨对虾种虾群体在某些性状比例参数上差异显著,在一定程度上产生了形态差异,但尚未达到亚种水平。     

不同养殖密度对中国明对虾生长和能量代谢的影响

本研究采用网箱养殖的方法,通过室内28 d的养殖实验,在4个养殖密度G1(100尾/ m3)、G2(200尾/m3)、G3(300尾/m3)、G4(400尾/m3)组中,研究不同养殖密度对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)生长、能量代谢和代谢酶活力的影响。结果显示,G2组的增重率(WGR)、相对增长率(AGR)和特定生长率(SGR)均最高,与G1组相比差异不显著(P>0.05);G3和G4组的体重差异系数(CVW)显著升高(P<0.05),其他生长指标和成活率(SR)均显著低于G1组(P<0.05);G4与G1组相比差异极显著(P<0.01)。随着养殖密度的增加,G3和G4组显著提高了血淋巴葡萄糖(Glc)、乳酸(LA)、丙酮酸(PA)的含量(P<0.05),显著降低了甘油三酯(TG)的含量(P<0.05);G2组4种指标含量与G1组相比差异不显著(P>0.05),而氨基酸含量在不同养殖密度之间变化不显著(P>0.05),表明在密度胁迫下,高密度对能源的需求增加,中国明对虾倾向性利用糖类脂类作为能源。另外,G3和G4组的己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、6-磷酸果糖激酶(6-PEK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性均显著升高(P<0.05),说明机体氧化代谢途径发生变化,分解代谢增强。琥珀酸脱氢酶(SDH)活性显著降低(P<0.05),表明三羧酸循环活性的降低,进一步表明密度胁迫抑制了组织的有氧代谢。研究表明,G3和G4组养殖密度显著影响了中国明对虾的生长,增加了碳水化合物和脂类利用,抑制了组织的有氧代谢。当中国明对虾为4.5 g时,其养殖密度100~200尾/m3为宜。     

刺参响应灿烂弧菌侵染的基因组DNA甲基化水平和转录组差异及其关联分析

为探讨病原菌胁迫下刺参(Apostichopus japonicus)基因组DNA甲基化水平和转录组表达的差异,本研究采用人工攻毒侵染胁迫,获得刺参化皮体壁组织,并以未攻毒组的健康体壁组织为对照,对刺参2种体壁组织进行全基因组甲基化测序(WGBS)和转录组高通量测序,解析刺参体壁基因组DNA甲基化差异,筛选响应病原胁迫的差异甲基化区域和差异表达基因。同时,通过基因组甲基化和转录组联合分析,筛选负相关关联基因,为解析刺参响应灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染的分子机理提供基础数据。结果显示,刺参对照组和侵染组基因组总甲基化水平分别为(3.59±0.04)%和(3.87±0.27)%,侵染组甲基化水平显著升高;在发生甲基化的位点中,攻毒组和对照组的mCpG占比分别为83.06%和81.91%,mCpG为最主要的甲基化形式。本研究共筛选出差异甲基化区域(DMRs) 626 677个,注释到23 706个功能基因。转录组测序共检测到29 290个基因,筛选到差异表达基因496个,其中,上调基因214个,下调基因282个。在基因组甲基化与转录组的关联分析中,筛选到180个负相关关联基因,其中,差异甲基化区域位于启动子区域的负相关基因为60个。对负相关关联基因的GO和KEGG富集分析,筛选到相关通路和LRR、hsp20和CARD等关键基因。本研究将为解析刺参抗病的表观遗传调控机制提供数据,也为刺参抗病性状选育提供科学参考。     

白斑综合征病毒2014年中国毒株变异区的序列比较

为研究白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)在中国不同地区的分子流行病学变异特征,对2014年1-8月期间在病害暴发区采集到的48份PCR检测阳性样本,用ORF75、ORF94和ORF125引物扩增目的片段,连接转化已克隆目的片段,测序分析不同样本ORF75、ORF94和ORF125重复序列数目的差异.结果显示,不同地区毒株ORF75的重复单元数目有4、10、11、12、13不等,ORF94的重复单元数目有4和14,而ORF125的重复单元数目有0、3、5、6、7不等.结果表明,流行在中国大部分地区的WSSV存在一定程度变异,毒株间的变异在ORF75、ORF94和ORF125上比较明显.     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)p38 MAPK基因克隆及表达分析

应用RACE克隆技术获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis) p38 MAPK基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析.结果显示,中国对虾p38 MAPK基因全长为1563 bp,开放阅读框长1098 bp,5′非编码区长122 bp,3′非编码区长343 bp,将该基因命名为Fcp38.氨基酸序列分析推测,该基因编码365个氨基酸,分子量为41.77 kDa,理论等电点为5.68.同源性分析表明,Fcp38基因与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38相似性最高,为98％.通过比对发现,该基因除含p38家族特有的标志性Thr-Gly-Tyr双磷酸化位点和底物结合位点Ala-Thr-Arg-Trp,还具有p38家族关键功能位点ED.系统进化分析显示,Fcp38与凡纳滨对虾和日本囊对虾的p38聚为一支.荧光定量PCR结果显示,Fcp38基因在肠、鳃、胃、心脏、淋巴、肝胰腺、肌肉、血细胞中均有表达,以在肌肉中表达量最高.氨氮胁迫后,该基因在中国对虾肌肉、血细胞、鳃、心脏、肠和胃中的相对表达量均显著增加,且有不同的时空表达趋势,表明Fcp38基因可能在中国对虾应对环境胁迫过程中起着重要作用.