进境冻畜禽产品中产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌耐药性的监测与分析

为监测进境冻畜禽产品中受产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)大肠埃希菌污染的情况,采用ESBL显色平板初筛结合Vitek2 compact确证及药敏测试的方法,经过与美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐方法(M100-S22)进行比对,并且通过对249份进境冻畜禽产品进行了检测.结果表明,采用的方法与CLSI推荐方法相比,具有快速、准确、操作简便和特异性好等优点,有良好的推广价值.同时,经检测获得产ESBL大肠埃希菌18株,占样品总量的7.23％.所获菌株对氨苄西林、头孢唑啉和头孢曲松高度耐药,多重耐药率为16.67％～38.89％,为检验检疫部门评估进境冻畜产品中受产ESBL大肠埃希菌污染的情况提供了科学数据.     

鲤疱疹病毒2型微滴式数字PCR检测方法的建立及比较分析

本研究建立了定量检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,并与实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测方法的灵敏性、重复性、特异性和临床样品检测做了比较分析.结果表明,与qPCR相比,ddPCR具有相同的特异性,其灵敏性比qPCR低20倍.在定量CyHV-2 DNA时,ddPCR (R2=0.994)和qPCR (R2=0.994)均表现出良好的线性关系,且2种检测方法间的定量值呈正相关(R2=0.989).在定量检测相同稀释度的CyHV-2 DNA时,qPCR的定量值始终比ddPCR高10倍.ddPCR的组内和组间重复变异系数(CV)分别为0.59％-11.26％和6.55％-23.21％,而qPCR为16.57％-27.56％和22.31％-56.73％,说明ddPCR具有更好的稳定性.在临床样品定量检测时,ddPCR的检出率稍高于qPCR.本研究建立的ddPCR能够准确定量检测CyHV-2,将为CyHV-2相关研究提供有益参考.     

绵羊痘病毒E3L蛋白N端结构和功能预测

E3L蛋白是痘病毒的一类早期表达的非结构蛋白,其主要抑制宿主的先天性免疫,与病毒的致病力和宿主嗜性有关,但是目前对绵羊痘病毒E3L蛋白的研究较少。作者运用生物信息学的方法,用已知的E3L蛋白N端结构作为模板,并使用WebLab、SWISS-MODEL和ExPASY等在线软件预测其功能结构域和二、三级结构及氨基酸组成,对其作为Zα潜在家族成员的真实性、可靠性作出理论上的判断。分析结果表明,绵羊痘病毒E3L蛋白N端结构符合Zα家族蛋白的一些基本的结构特征,具有其他E3L蛋白N端相同的功能结构,为该蛋白质N端结构属于Zα蛋白家族提供了一些理论依据。     

绵羊痘病毒固原株L2R基因的克隆与生物信息学分析

为分析绵羊痘病毒L2R蛋白的分子特征,本试验提取了绵羊痘病毒固原株（GY）的基因组DNA,设计L2R基因引物,对L2R基因进行扩增,将扩增的基因连接到pGEM-T Easy载体后转化到大肠杆菌Trans 5α感受态细胞,筛选阳性克隆,进行序列测序。利用生物信息学软件对L2R基因序列进行预测分析。结果显示,L2R基因序列含有一个由279个核苷酸组成的开放阅读框,编码92个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量理论值为10.92 ku,理论等电点为6.56。该蛋白质二级结构组成分别是α-螺旋占69.57%,β-折叠占9.78%,无规则卷曲占8.70%,延伸链占11.96%。多序列比对分析结果显示,不同羊痘病毒分离株L2R序列高度保守。进化树分析结果显示,GY株与NK、TU及SA株在一个分支,表明它们之间亲缘关系较近。本试验结果为进一步研究L2R蛋白的生物学功能和羊痘病毒早期蛋白的分子相互作用奠定了基础。     

猪弓形虫病特异PCR诊断方法的建立

以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记．建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法。应用人工感染的方法建立了猪弓形虫病动物模型．摸索出猪弓形虫病PCR检测的最佳条件。敏感性和特异性试验结果显示，该PCR方法最低能检测到10个弓形虫速殖子的DNA，且与相关的8种原虫和线虫均无交叉反应，证明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性。动物感染试验结果证明．在试验猪出现明显临床症状时(感染后第5d)．对取材的8个组织样品用该PCR方法检测，有6个组织样品为阳性，其中检出率最高的组织为肺门淋巴结。     

猪水泡病病毒VP1重组蛋白的表达及抗原性检测

本研究利用猪水泡病病毒外壳蛋白VP1基因和pGEX-4T－1质粒成功构建重组质粒pGEX-4T－1－VP1，并转入BL21（DE3）表达菌中，经IPTG诱导后通过SDS-PAGE凝胶电泳实验和考马斯亮蓝染色，结果显示在57KDu处出现特异性表达条带。经免疫印迹试验证实本研究所表达的重组蛋白VP1具有抗原性，可为利用重组蛋白VP1建立间接ELISA方法检测猪水泡病奠定基础。     

水生动物中分离的副溶血性弧菌菌株分子分型研究

本研究通过采用核糖体分型RT、脉冲场凝胶电泳PFGE、多位点序列分型MLST三种方法,对从水生动物中分离到的59株副溶血性弧菌进行分子分型研究。结果将59株副溶血性弧菌分为43个RT型,9个大的聚类群,DI为0.9754;51个PFGE型,13个大的聚类群,DI为0.9988;53个ST型,包括107个新的等位基因、46个新的ST型,DI为0.9982。结果显示PFGE的分辨力最高,MLST较PFGE稍低,RT的分辨力最低。总体来看59株副溶血性弧菌菌株间亲缘关系较远,从同一年份、同一地区、同类样品中分离到的菌株被分为不同的型,表现出较大的遗传多样性。     

检疫性疫霉DNA条形码筛选

 疫霉是世界关注的一类植物病原真菌。以疫霉属80个种122个菌株为研究材料,以ITS、CO1、EF-1α和β-tubulin 4个基因片段为候选DNA条形码,分析表明ITS、CO1基因的PCR扩增和测序成功率最高,分别为100%和96.7%;ITS、CO1和β-tubulin存在明显的条码间隔,但种间、种内距离频率分布存在较小重叠;种间、种内遗传距离Wilcoxon秩和检验结果认为各基因对种内遗传距离的效力相等,对种间遗传距离的区分能力为ITS>CO1>β-tubulin。CO1基因和ITS片段可同时作为11种检疫性疫霉的首选DNA条形码,β-tubulin基因可作为辅助DNA条形码。     

非洲猪瘟病毒抗体检测间接ELISA方法的建立

以基因工程表达的非洲猪瘟病毒VP73蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用以检测猪血清中抗非洲猪瘟VP73蛋白的抗体。该方法对非洲猪瘟标准阳性血清的检测灵敏度可以达到1∶2 560,与同类进口ELISA试剂盒相当。此方法只特异性检出非洲猪瘟阳性血清,而对猪传染性胸膜肺炎等5种猪传染病阳性血清的检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。批内和批间重复性试验结果发现,检测同一份血清的变异系数小于10%,表明其重复性较好。包被好的酶标板37℃放置5d后,对同一份血清的检测敏感性无明显变化,初步表明其稳定性较好。利用建立的间接ELISA方法和进口ELISA试剂盒分别对150份血清样品进行非洲猪瘟血清抗体检测,结果表明本方法的特异性和敏感性分别为99.1%和94.3%,2种方法检测结果的符合率为98%。以上试验表明,本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性,可以满足临床检测的需求。     

传染性鲑鱼贫血症病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病毒没有交叉反应。结果表明,本研究建立了ISAV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,实验能对整个扩增过程进行实时监测,提高检测灵敏度的同时,防止由于开盖跑电泳或加染料而导致的污染。