基于Ecopath模型的大亚湾黑鲷生态容量评估

为评估大亚湾黑鲷(Sparusmacrocephalus)的生态容量,根据2015年渔业资源和生态环境调查数据,利用Ecopathwith Ecosim6.5(EwE)软件构建了由26个功能组组成的大亚湾Ecopath模型,分析了大亚湾生态系统的基本特征,并结合食物网结构和能量流动估算了黑鲷的增殖生态容量。结果显示,黑鲷营养级为3.44,营养转化效率为0.302;大亚湾生态系统各功能组的营养级在1～3.95之间,系统总转化效率为7.636%,总初级生产量/总呼吸量为2.142,系统连接指数为0.364,系统杂食性指数为0.210,表明系统各营养级转化效率较低,能量未被充分利用;系统总转化效率低于10%,营养级I、II流向碎屑量占总流向碎屑量的98.11%,说明能量传递发生阻塞,具有增殖空间。经估算黑鲷生态容量为0.034 t/km2,是现存生物量的1.4倍,此时其他浮游生物食性鱼类的转化效率等于1,系统处于平衡状态;达到生态容量前后大亚湾生态系统的总初级生产量/总呼吸量变化很小(变化值为0.001),系统杂食性指数和系统连接指数均没有变化,因此认为放流黑鲷至生态容量对大亚湾生态系统的稳定性和营养结构未产生影响。     

拟穴青蟹保幼激素酯酶结合蛋白(JHEBP)基因的克隆与表达分析

甲基法尼酯(MF)是甲壳类的保幼激素(JH), MF的代谢可能主要由保幼激素酯酶(JHE)催化完成,保幼激素酯酶结合蛋白(JHEBP)能紧密结合JHE,在JHE的代谢中具有重要作用,研究JHEBP对于MF降解通路的探究具有一定促进作用。本研究获得了拟穴青蟹JHEBP基因的cDNA全序列,命名为Sp-JHEBP。Sp-JHEBP序列全长为1647 bp,包含一个891 bp的开放阅读框(ORF),可编码296个氨基酸,预测相对分子质量33.79 kD,等电点8.63。利用Target P预测Sp-JHEBP定位于线粒体, Mitoprot预测Sp-JHEBP的前31个氨基酸组成的肽段为线粒体定位信号肽。多重序列比对分析发现, Sp-JHEBP的氨基酸序列与多齿新米虾(Neocaridina denticulata)的一致度最高(67%),其次为黑脉金斑蝶(Danaus plexippus)(43%)。系统发育树分析JHEBP与物种分化并不一致,这表明JHEBP随着物种分化,功能上可能也出现了分化。Sp-JHEBP在所检测的9个组织中均有表达,在卵巢中的表达量远高于其它组织,其次是鳃、血淋巴、肝胰腺。在幼体发育过程中,Sp-JHEBP在受精卵时期最高,从Z1至Z5期逐渐升高,到Z5期达到最高,随后逐渐下降到C1期。体外处理MF和法尼酸(FA)显示Sp-JHEBP受高浓度MF上调,在0.1～5μmol/L之间随着FA浓度升高Sp-JHEBP表达量升高。综合分析我们认为Sp-JHEBP可能通过降解JHE来参与MF的代谢,该研究结果对青蟹MF降解分子网络的研究具有一定的推动作用。     

养殖2龄赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)的营养价值与畸形原因分析

分析了在工厂化条件下养殖的赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)出现的畸形现象,发现其发育畸形特征可分为脊椎畸形和鳃颌畸形两大类。为了获得其营养学研究的基础资料,采用营养学方法测定和分析了正常、脊椎畸形、鳃颌畸形3种类型的鱼形体指标、肌肉成分及品质。结果显示,(1)脊椎畸形与鳃颌畸形鱼的全长、肌肉率分别为(21.97±1.50) cm、(71.12±1.45)%和(22.43±0.12) cm、(71.28±0.39)%,都与正常鱼的指标值(25.70±0.75) cm、(78.58±0.20)%差异显著;(2)3种类型鱼的肌肉中粗蛋白和粗灰分含量比较接近,差异不显著。脊椎畸形鱼的粗脂肪含量为(3.55±0.06)%,与正常鱼和鳃颌畸形鱼(2.71±0.07)%、(2.48±0.01)%差异显著;(3)脊椎畸形鱼的氨基酸总量(TAA)和必需氨基酸指数(EAAI)分别为(17.55±0.65)%、83.04,鳃颌畸形鱼分别为(15.89±0.11)%、73.82,低于正常鱼的(19.86±0.52)%和89.25;(4)从内聚性、弹性、胶粘性和咀嚼性4个方面对3种类型鱼的肌肉品质评价研究表明,上述4个指标值的大小(规律)为正常鱼＞脊椎畸性鱼＞鳃颌畸形鱼。两类畸形鱼的营养价值低于正常鱼,其中鳃颌畸形鱼的最低。实验还对3类鱼脊椎、鳃颌骨中的 Cu、Zn、Fe、Mn、Ca、P 等含量进行了测定,研究表明,脊椎中其他各元素间含量差异不显著,仅有Fe、Mn 差异显著,说明 Fe、Mn 可能造成人工养殖的赤点石斑鱼脊椎畸形。     

微粒饲料中以微藻粉替代鱼油对牙鲆(Paralichthys olivaceus)稚鱼生长存活和脂肪酸组成的影响

以18日龄的牙鲆(Paralichthys olivaceus)稚鱼为研究对象,通过11 d 的生长实验,研究了添加不同比例的微藻粉替代鱼油对牙鲆稚鱼生长、存活率和脂肪酸组成的影响。以鱼油组(FO)为对照组,以裂壶藻粉(Schizochytrium sp.)、微绿球藻粉(Nannochloropsis sp.)和橄榄油替代不同比例的鱼油,配制成5组等氮等能的实验饲料,分别命名为鱼油组(FO),50%混合替代组(M50)、100%混合替代组(M100)、100%裂壶藻橄榄油替代组(S100)、100%微绿球藻橄榄油替代组(N100)。结果显示,微藻粉替代鱼油对牙鲆稚鱼的生长无显著影响;含有裂壶藻的各饲料组(M50、M100、S100)成活率显著高于 FO 组和 N100组(P?0.05);微藻粉替代鱼油不影响牙鲆稚鱼主要脂肪酸的组成;Person相关性分析发现,C14：0、C16：1n-7、C18：2n-6、C20：0、C18：3n-3、C22：0、C20：4n-3、EPA、C22：5n-6和 DHA 的百分含量均与其饲料中的百分含量呈显著正相关(P<0.05);总饱和脂肪酸、总单不饱和脂肪酸、n-3多不饱和脂肪酸的百分含量以及 DHA/EPA 比率均与其饲料组成表现出显著正相关(P<0.05)。综上所述,微藻作为脂肪源替代鱼油完全可以满足牙鲆稚鱼的生长和发育,各种脂肪酸均可以被牙鲆稚鱼充分消化和吸收,并且添加两种微藻后提高了稚鱼的 DHA 含量和 DHA/EPA 比率,与鱼油对照组相比显著提高了牙鲆稚鱼的成活率。因此,以微藻替代鱼油在牙鲆稚鱼的培育中是可行的。     

云纹石斑鱼(E. moara)(♀)×七带石斑鱼(E. septemfasciatus)(♂)杂交F1生长特征与其亲本子代的比较

为获得在工厂化养殖条件下的生长特性和规律,分别对10-14月龄的云纹石斑鱼、七带石斑鱼及其杂交F1 3个群体的体长、体重、生长指标、肥满度、超亲优势率等主要生长参数进行测定、比较和分析,并对3个群体的生长模型进行方程拟合。结果显示,在体长和体长生长指标方面,依次为杂交F1>云纹石斑鱼>七带石斑鱼;10-11、13月龄时,累积体重值依次为杂交F1>七带石斑鱼>云纹石斑鱼,体重和体重生长指标方面,增重依次为云纹石斑鱼>七带石斑鱼>杂交F1;七带石斑鱼的肥满度始终最高,杂交F1次之。研究表明,杂交F1体长生长速度最快,且在11月龄前的体重生长速度最快;云纹石斑鱼在11月龄后体重增长速度加快并超过其他两个群体;每月体长、体重生长值的超亲优势率分析显示,杂交F1在14个月的生长中表现出杂种优势。云纹石斑鱼为等速生长类型,七带石斑鱼与杂交F1同属于异速生长类型。     

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测

根据GenBank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei) (EHP) SSU rDNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR (qPCR)检测方法.结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101-8.3×108 copies/μ1的EHP SSU rDNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=-3.369 log(Sq)+39.364 (R2=0.992),扩增效率为98.1％,检测灵敏度下限为8.3× 10(1) copies/μ1,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性.对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍.利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA (HpDNA)中的EHP SSU rDNA进行了qPCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng HpDNA)时代表了较高的风险水平.本研究建立的qPCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考.     

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)中溶源噬菌体与其宿主菌致病力的相关性

急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND)是由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的对虾病害,本研究从患AHPND的凡纳滨对虾样品中分离得到5株副溶血弧菌,采用致AHPND的副溶血弧菌(VPAHPND)的相关质粒的引物AP2进行PCR检测,表明这5株菌中均存在AHPND相关质粒.利用丝裂霉素C进行溶源性噬菌体筛选和噬菌体诱导发现,其中2株副溶血弧菌(20130629002S01和20130726001S01)可能存在溶源性噬菌体感染;从经0.5 μg/ml丝裂霉素C诱导的20130629002S01和20130726001S01中分别分离得到两种噬菌体phage1和phage2.透射电镜观测显示,phage1为有尾噬菌体,phage2为球形噬菌体.将上述5株副溶血弧菌进行卤虫无节幼体人工感染实验,结果显示,它们对卤虫无节幼体均有致病力,且各分离株的毒力表现出显著性差异;20130629002S01和20130726001S01两株带有溶源性噬菌体的副溶血弧菌的致病力显著低于无噬菌体的副溶血弧菌(20130721001S02).本研究结果表明,5株VPAHPND分离株都含有AHPND相关的质粒,表现出显著的毒力差异,可能携带不同的溶源噬菌体,也可能不携带溶源噬菌体,溶源噬菌体与副溶血弧菌各分离株的毒力并无必然相关性.     

普通刺参(Apostichopus japonicus)和白刺参不同组织基因组DNA的MSAP研究

本研究分别以普通刺参(Apostichopus japonicus)和白刺参基因组DNA为实验材料,应用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术对刺参体壁、呼吸树和消化道3个组织的DNA甲基化水平和甲基化模式进行了研究,初步探讨了DNA甲基化对刺参组织间基因特异性表达的影响.结果显示,筛选得到的9对引物组合能够在普通刺参和白刺参两个群体中得到稳定扩增,在两群体刺参中分别检测到5932和5208个位点,均以未甲基化位点为主,普通刺参和白刺参未甲基化位点数分别为4317和3944,分别占总扩增条带数的72.78％和75.73％.普通刺参体壁的甲基化水平为31.07％,呼吸树为23.36％,消化道为26.34％;白刺参中体壁的甲基化水平为29.88％,呼吸树为23.25％,消化道为19.45％,由此可见,体壁的甲基化率在两群体中是最高的.普通刺参和白刺参同一组织间的甲基化水平和甲基化模式不同,同一群体体壁、呼吸树和消化道不同组织间的甲基化水平和模式也不同.甲基化在普通刺参和白刺参组织分化和发育过程中可能发挥着十分重要的作用.在检测的3个组织中,CCGG序列的全甲基化位点较半甲基化位点多.     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) Nramp基因克隆与表达分析及SNP筛选

天然抗性相关巨噬细胞蛋白(Natural resistance-associated macrophage protein, Nramp)属于膜整合转运蛋白,具有抑制胞内寄生菌侵染、调节巨噬细胞的抗菌活性等作用。本研究对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Nramp基因进行了克隆和表达分析,并对其与抗鳗弧菌感染相关的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)位点进行了筛选。该基因cDNA序列全长3717 bp,其中开放阅读框(Open reading frame, ORF)1677 bp,所编码蛋白含有558个氨基酸,该蛋白具有Nramp家族的典型特征,包括10个跨膜区(Transmembrane, TM)、1个由20个氨基酸残基组成的胞质内转运蛋白特征结构域(Consensus Transport Motif, CTM)。半滑舌鳎Nramp的ORF末端有1个类似于脊椎动物Nramp2中的铁反应控制蛋白结合位点(Iron-responsive regulatory protein-binding site, IRE)。半滑舌鳎Nramp与其他14个物种的Nramp氨基酸序列同源性在63%?91%之间,系统进化分析表明,半滑舌鳎Nramp和所有鱼类Nramp聚集为一簇,与其他物种Nramp2的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析显示,Nramp基因在半滑舌鳎脾脏和肾脏中的表达量最高,而在肌肉和性腺中的表达量最低;在哈维氏弧菌感染的半滑舌鳎肾脏、脾脏和肝脏中表达量呈升高趋势,而在鳃中则表现为下调趋势。利用直接测序法检测感染鳗弧菌后同一家系的233个个体(抗病个体165个,感病个体68个),共检测到15个SNP位点,对其中3个SNP 位点即 SNP-g.3113(T→C)、SNP-g.3125(A→G)和 SNP-g.3164(A→T)进行测序分型后发现,SNP- g.3125(A→G)的等位基因(G)频率和基因型(GG)频率与半滑舌鳎抗鳗弧菌疾病呈极显著相关(P<0.01)。研究结果表明,Nramp 基因不同基因型对半滑舌鳎的抗病能力有着极其重要的影响,SNP-g.3125(A→G)可作为潜在的抗性遗传标记位点。本研究将为半滑舌鳎抗性品系培育提供技术支持。     

引起半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗大规模死亡的神经坏死病毒病

2012和2013年,山东某育苗场15–20日龄的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)鱼苗出现暴发性大规模死亡,7 d内死亡率高达90%–100%。本研究调查了疾病的发生情况和临床特征,采集病鱼样品进行了组织病理学检查,并运用RT-PCR方法进行了病原的检测和基因序列分析。结果发现,半滑舌鳎鱼苗一般在7月和8月发病,发病时养殖水温为22–24℃。病鱼游泳行为异常,表现为上下翻游、螺旋性游动、全身大幅度波浪状浮动症状,但病鱼体表无出血和溃疡症状。组织病理检查发现,病鱼脑和视网膜组织出现严重的空泡化及坏死。病鱼样品的RT-PCR检测结果全部呈鱼类神经坏死病毒阳性。对得到的RT-PCR产物测序,进行BLAST比对,发现该病毒与鱼类神经坏死病毒的赤点石斑鱼神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)基因型的相似性达98%以上,而与鱼类神经坏死病毒的其他3个基因型：黄带拟鲹神经坏死病毒(Striped jack nervous necrosis virus,SJNNV)、红鳍东方鲀神经坏死病毒(Tiger puffer nervous necrosis virus, TPNNV)和条斑星鲽神经坏死病毒(Barfin flounder nervous necrosis virus,BFNNV)的相似性仅为71%–78%。由此可以判定,本研究发现的引起半滑舌鳎鱼苗大规模死亡的神经坏死病毒为RGNNV基因型,半滑舌鳎也是鱼类神经坏死病毒的天然宿主。该发现在半滑舌鳎疾病防治和鱼类神经坏死病毒的流行机制研究方面都具有重要意义。