鸭病毒性肠炎病毒的提纯及其结构蛋白SDS-PAGE分析

将鸭病毒性肠炎病毒（DEV）分离株SC-1经鸭胚成纤维细胞培养增殖后，采用差速离心结合蔗糖不连续密度梯度离心法进行提纯，获得多量、纯净的完整病毒粒子。病毒粒子主要位于40％～50％蔗糖层交界处，电镜下可观察到DEV具有典型的疱疹病毒特征，完整病毒粒子由囊膜、衣壳和核芯3个部分组成，直径为170～190nm。将纯化的DEV粒子经SDS—PAGE分析，发现其结构蛋白由11种多肽组成，即VP1（190000）、VP2（136000）、VP3（106000）、VP4（88000）、VP5（75000）、VP6（68000）、VP7（56000）、VP8（48000）、VP9（42000）、VP10（38000）和VP11（32000）．其中VP1、VP2、VP3、VP6、VP8和VP9等6条蛋白区带的相对百分含量较高，约占病毒结构蛋白总量的89．04％，为DEV的主要结构多肽。     

BVDV、BRV和BCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCoV)的快速检测方法,根据GenBank中登录的BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因序列设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,建立了同时检测上述3种病毒的TaqMan三重RT-qPCR方法。该方法仅对BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因扩增呈阳性,而对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、魏氏梭菌(A型、B型和D型)、多杀性巴氏杆菌(A型和B型)等犊牛腹泻相关病原扩增均呈阴性;最低检出限为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。利用本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法对29份临床样品进行检测,获得BVDV、BRV、BCoV的4种混合感染型,其中BVDV与BCoV的混合感染率最高(27.6%);与已有单重RT-qPCR方法比较,发现两种方法检测BVDV、BRV和BCoV的符合率分别为100%、96.5%、100%。结果表明,本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、可行性高等优点,可为今后BVDV、BRV和BCoV共感染引起的牛腹泻性疾病的鉴别诊断和流行病学调查提供新技术手段。     

BHV-1感染牛巨噬细胞对CD300a转录的影响

为探究抑制性受体CD300a在牛Ⅰ型疱疹病毒(bovine herpesvirus 1,BHV-1)免疫调控机制中的作用，分离鉴定了1株BHV-1内蒙古株，并建立CD300a基因的荧光定量PCR方法，检测BHV-1感染牛单核巨噬细胞后0,6,12,24,48,72 h 6个时间点以及空白对照组CD300a基因的转录变化。将β-actin基因作为内参，使用双标准曲线法计算攻毒组与对照组CD300a基因各时间段的相对表达量，分析CD300a在攻毒前、后的表达差异。结果显示，BHV-1分离株在MDBK细胞上出现典型细胞病变效应，测得其病毒滴度为10^7.23 TCID₅₀/mL。本研究建立的CD300a基因荧光定量PCR检测方法，CD300a基因和β-actin基因标准品的Ct值与模板浓度之间均具有良好的线性关系，溶解曲线均为特异单峰，最低检测限均为10拷贝/μL,具有良好的灵敏性，可以准确检测出BHV-1攻毒后巨噬细胞内的CD300a基因表达量。经计算，攻毒组CD300a表达量均高于对照组，其中，6,12,24 h的表达差异倍数显著高于0,72 h...     

牛轮状病毒和志贺菌阳性犊牛腹泻粪便样本中肠道菌群的分析

犊牛感染不同病原所引发的腹泻可导致肠道菌群结构特征的改变。为研究其肠道菌群的多样性，从内蒙古西部地区选取3个规模化养牛场采集新鲜粪便样本38份，其中腹泻粪样30份，健康粪样8份。采用PCR方法进行腹泻相关病原检测后分为3组，分别为健康组(HC)、牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)感染腹泻组(DC＿a)和埃希菌属-志贺菌感染腹泻组(DC＿b)。提取总DNA,采用通用引物对细菌16S rDNA基因的高可变V3-V4区进行PCR扩增，采用Illumina NovaSeq平台进行测序，对测序结果进行生物信息学分析。结果发现，α多样性指数表明腹泻犊牛与健康犊牛肠道微生物多样性存在差异且DC＿b组α多样性显著低于其余两组(P<0.05);在门水平上，3组的优势菌门均为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门，但其相对丰度差异显著，DC＿b组厚壁菌门显著降低(P<0.05),放线菌门显著增加(P<0.05);在属水平上，3组的优势菌属不同且相对丰度也有差异。通过PICRUSt2功能预测分析表明，与HC组相比，DC＿a组在甘露糖降解、半乳糖降解、糖和维生素的生物合...     

小檗碱对小鼠感染犊牛源生物被膜阳性、多重耐药大肠杆菌的体内抑菌作用

为阐明小檗碱对小鼠感染犊牛源生物被膜阳性、多重耐药大肠杆菌的体内抑菌作用，试验采用微量肉汤稀释法确定41株分离株的MIC值|采用改良结晶紫染色法，确定其生物被膜形成能力|采用ELISA法检测小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量|采用血常规检测小鼠血液中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数目及血红蛋白含量。结果显示：分离菌株对四环素、氨苄西林、甲氧苄啶、磺胺嘧啶耐药率较高，对阿米卡星、米诺环素、头孢西丁较为敏感|生物被膜形成能力无、弱、中、强的菌株数分别为14、10、7、10株|生物被膜阳性大肠杆菌耐10种以上药物的菌株占比73.9%，且多重耐药菌株占比66.7%|生物被膜强阳菌株中的多重耐药菌株占比80%|小檗碱高、低剂量组及联合给药组可不同程度降低小鼠血清中促炎因子的含量，降低血液中白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数目，并升高血红蛋白浓度。犊牛源大肠杆菌形成生物被膜可增强自身多重耐药性，且小檗碱具有成为临床治疗由生物被膜阳性、多重耐药大肠杆菌引起的犊牛腹泻病药物的潜力。 [关键词] 犊牛|大肠杆菌|生物被膜|小檗碱|促炎因子     

牛纽布病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

牛纽布病毒(bovine nebovirus, BNeV)是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原，为了建立快速、准确且能定量分析BNeV的检测方法，本试验根据GenBank上发布的BNeV聚合酶基因(RdRp)序列设计合成了1对特异性引物和1条探针，并通过优化反应体系，成功建立了BNeV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并对临床样品进行检测。结果表示，该方法最佳上下游引物浓度均为500 nmol/L,探针浓度为400 nmol/L,在1×10⁸～1×10¹拷贝/μL之间呈现良好的线性关系，线性相关系数R²=0.996,扩增效率为105.9%;该方法特异性较强，在多个犊牛腹泻相关病原中，只检测出BNeV;敏感性较高，对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10¹拷贝/μL,而普通PCR对BNeV质粒标准品最低检测下限为1×10³拷贝/μL;重复性较好，组内变异系数和组间变异系数均小于3%;对2021年3-5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BNeV的检出率为35.1%,...