猪链球菌4型分离株生物学特性研究

为分析猪链球菌4型(Streptococcus suis type 4,SS4)分离株的病原生物学特性,试验对来自中国不同地区的10株猪链球菌4型进行了多位点序列分型,通过PCR方法对猪链球菌7个保守管家基因aroA、gki、dpr、mutS、recA、thrA、cpn60进行扩增,测序后将结果上传至MLST数据库查找序列型,然后制作聚类分析图来阐明菌株之间的亲缘关系;采用PCR方法对7种主要的毒力基因gdh、mrp、epf、sly、fbps、gapdh与orf2进行鉴定,通过毒力因子谱来分析猪链球菌4型毒力因子的分布;以纯化的10株细菌对BALB/c小鼠进行动物致病性试验,根据小鼠致死数量筛选出最强毒株,并进行新西兰兔致病性试验。结果显示,10株猪链球菌4型经多位点序列分型,6株为ST850型,3株为ST1006型,1株为ST94型;结合菌株分离地区分析发现,广东和江苏地区菌株有较高的同源性,江沪地区菌株出现分化现象,表现为遗传多样性;10株菌株均检测到了gdh、gapdh和orf2毒力基因,7株检测到sly基因,4株检测到fbps基因,根据毒力因子谱发现共有3个毒力基因型,gdh+sly+gapdh+orf2+型有6株,gdh+fbps+gapdh+orf2+型有3株,gdh+sly+fbps+gapdh+orf2+型仅有1株。动物致病性试验表明,10株细菌均能使BALB/c小鼠死亡,其中SH1510的半数致死量低至1×108 CFU,对小鼠的致病性最强,将纯化的SH1510菌液接种新西兰兔,可使新西兰兔出现典型的神经症状并死亡。以上结果为猪链球菌的遗传进化、毒力研究提供了新的数据,丰富了猪链球菌病的研究。     

类圆环病毒因子P1感染对猪外周血T淋巴细胞含量和增殖活性的影响

探讨类猪圆环病毒因子P1感染对猪细胞免疫功能的影响.将12头30日龄广西巴马小型猪随机分成试验组和对照组,每组6头.在猪感染P1后第3,8,17,24,31和40天,采用血常规和单色流式细胞术分析猪外周血T淋巴细胞的含量,通过WST法对其增殖活性进行检测.P1感染组的T淋巴细胞数量(绝对数和相对数)整体趋势低于对照组,而两组的T淋巴细胞增殖活性没有显著差别.P1感染对机体的细胞免疫功能有一定程度的影响.     

国内病猪中猪链球菌2型分离株溶血素基因的PCR检测及序列分析

以探明猪链球菌2型(SS2)国内病猪分离株的溶血素基因(sly)的分布情况及其序列为目的.通过聚合酶链反应(PCR)方法检测29株不同年代、不同地区SS2国内分离株的sly,并将其中的5株(SS2-1、HA9801、HA0507、JR0507和ZY05719)sly 进行克隆及序列分析.结果显示:29株菌都有sly,其中5株菌的sly的ORF的碱基数目都为1 494 bp、编码497个氨基酸,核苷酸序列的同源性为99.7%～100.O%,所推导的蛋白质序列的同源性为99.8%～100.O%,其中SS2-1、HA9801、HA0507、JR0507与国外参考株P1/7的序列完全一致.表明中国猪链球菌2型病猪分离株普遍具有sly,且基因序列极为保守.     

类猪圆环病毒2型因子P1和P2诱导PK-15细胞凋亡的研究

为了研究类猪圆环病毒2型因子P1和P2体外诱导的细胞凋亡作用,将P1和P2分子克隆分别转染PK-15细胞。结果表明,用透射电镜可以观察到P1和P2诱导PK-15细胞出现凋亡的典型形态学变化。     

藏猪猪链球菌的分离鉴定及其致病性和药物敏感性分析

为了解西藏林芝市藏猪猪链球菌感染情况、分离株生物学特性及其耐药情况。本研究针对来自西藏林芝市312份健康藏猪的样品进行了猪链球菌的分离鉴定、血清型分型、毒力因子检测、生化鉴定、致病性试验、药敏试验。结果显示,在312份样品中检出71份猪链球菌阳性(22.76%),检测出22种血清型。细菌分离培养得到4株革兰氏阳性菌,分离菌的菌落形态、菌体形态与链球菌相符;根据生化试验及PCR鉴定结果判定4株分离菌均为猪链球菌;PCR血清型分型结果显示,其中1株为16型(Ss16 LZ1)、1株为30型(Ss30 LZ1)、2株为31型(Ss31 LZ1、Ss31 LZ2);毒力基因检测结果,Ss16 LZ1、Ss30 LZ1表现为sly^–epf^–mrp^–orf2^–fbps⁺,Ss31 LZ1、Ss31 LZ2表现为sly^–epf⁺mrp^–orf2^–fbps⁺;致病力试验显示,Ss16 ...     

两株猪圆环病毒2型的分离鉴定和小鼠致病性试验

采集自江苏某猪场临床表现为疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的猪组织病料,经PCR检测为猪圆环病毒2型(PCV2)阳性,阳性病料经无菌处理后接种PK-15细胞进行PCV2分离并进行测序。采用间接免疫荧光(IFA)和相关基因序列分析软件进行鉴定、分析。用分离的毒株人工感染BALB/c小鼠,观察其对小鼠的致病性。结果显示,成功分离到2株PCV2毒株,分别命名为X46和5123,两毒株基因全长均为1 767 bp,遗传进化和同源性分析显示两毒株分别为PCV2d和PCV2b亚型,分离株P20代毒在PK15细胞上的TCID_(50)分别为10~(5.5)TCID_(50)/0.1 mL和10~(4.5)TCID_(50)/0.1 mL。小鼠感染试验结果显示PCV2对小鼠增重有抑制作用,对肝、脾和肾有较强的侵袭能力。研究结果为深入研究PCV2的致病机理及开发新型疫苗奠定了一定的基础。     

猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白部分片段的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)抗体间接ELISA检测方法,该研究首先克隆了MRP编码基因的部分片段,构建了重组表达质粒pET28a-mrp,并将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,获得了58 000的重组蛋白,经Ni柱纯化后,免疫印迹显示MRP重组蛋白能够被猪链球菌2型抗体特异性识别。以纯化的MRP重组蛋白作为包被抗原,建立了猪链球菌2型MRP抗体检测间接ELISA方法。该ELISA方法的包被抗原浓度为10μg/ml,待检血清1∶50稀释,检测临床48份未免疫猪链球菌2型疫苗健康猪的血清。当效价(S/P)≥0.22时,判定待检血清样品为阳性;当S/P<0.22时,判定待检血清样品为阴性。运用建立的方法能特异性识别猪链球菌2型抗体,人工感染猪的MRP抗体于攻毒后14～28 d出现峰值,同时提示临床健康猪群的免疫功能存在个体差异。     

H7-HCP-Tir-Intimin高效降低小鼠粪便中大肠杆菌O157:H7排菌

构建BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae),并评价对小鼠的免疫原性,以期研制更加有效的候选免疫原,最大限度降低E.coli O157:H7对食物、环境和人类的危害。将946、423、309、811bp的fliC,hcpA,tir和eae基因被依次克隆,中间添加8个氨基酸的间隔序列,构建重组菌BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae)。进口白油和ISA50V作为佐剂与重组蛋白乳化,制备2种油乳剂疫苗,分别接种4周龄BALB/c雄鼠,二免21d,口服攻击E.coli O157:H7109 CFU/只,每天采集粪便,检测排菌。结果显示,2种重组疫苗均能够诱导高滴度血清IgG。ISA50V佐剂组抗体产生早于进口白油佐剂组,但进口白油佐剂组抗体滴度一致性更好。所有免疫组小鼠排菌极度降低,第1天排菌低于104 CFU/g,第5天检测不到排菌,整个检测期无反弹,而对照组在整个检测期排菌持续很高(>104 CFU/g)。结果表明,四价重组蛋白H7-HCP-Tir-Intimin能够高效降低口服大肠杆菌O157:H7后的排菌,极显著降低细菌的定植,很大程度减少病原传播,对环境和人类的威胁。     

猪源马链球菌兽疫亚种类M蛋白原核表达及其小鼠免疫保护力分析

为了原核表达猪源马链球菌兽疫亚种去除信号肽的类M蛋白质,并分析该蛋白质对小鼠的免疫保护力,克隆了马链球菌兽疫亚种CY菌株去除信号肽的类M蛋白质基因Szp,并将Szp基因插入p ET28a表达载体,IPTG诱导,获得重组类M蛋白质,弗氏佐剂乳化重组类M蛋白质后,3次免疫小鼠,用同源菌株CY攻击。诱导获得分子量约5.8×104的重组蛋白质,免疫印迹结果表明该重组类M蛋白质能够被马链球菌兽疫亚种猪多抗识别。类M蛋白质免疫小鼠的存活率为60%,弗氏佐剂乳化灭活CY免疫小鼠的存活率为70%,PBS对照组小鼠攻毒后6 d内全部死亡。表达的类M蛋白质可以给予ICR小鼠部分的免疫保护力,保护效果略低于CY全菌灭活苗,提示可以对马链球菌兽疫亚种多种免疫保护性抗原进行联合,从而进一步提高对动物的免疫保护力。