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本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88的热不稳定性肠毒素(heat-labile toxin,LT)基因进行无痕敲除并获得K88 LT-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。 相似文献
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皖南黄肉种鸡种蛋中禽白血病病毒的感染状态检测 总被引:2,自引:0,他引:2
本研究首次通过检测种蛋中禽白血病病毒(ALV)评价了皖南黄父母代肉种鸡的ALV感染状态.收集该鸡群的120枚鸡蛋,取40枚鸡蛋孵化至9~11 d后分别制备CEF,培养10 d,取细胞上清用ELISA试剂盒检测ALV p27抗原.另取80枚鸡蛋卵白直接检测p27抗原,同时分别将80枚鸡蛋卵白接种CEF(DF1),培养10 d后取细胞上清检测p27抗原.比较p27阳性检出率的结果表明,受精蛋孵化9~11 d后制备CEF,再培养10 d的细胞上清检出率(10/36)高于直接检测卵白(17/80)与卵白接种CEF(DF1)的细胞上清(7/80).将经DF1培养后p27抗原阳性样品,用针对ALV-J的单抗JE9做IFA,ALV-J的阳性率为6/7.检测该80枚鸡蛋的卵黄抗体,ALV-J、ALV-AB的抗体阳性率分别为18/80、1/80.结果表明,该皖南黄父母代肉种鸡群存在的外源性ALV感染主要为ALV-J.该研究为ALV的净化提供了可行性检测方法. 相似文献
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为构建猪链球菌(Streptococcus suis)蛋白表面展示系统,本研究通过序列分析,确定猪链球菌的LPxTG蛋白及其信号肽(SP)和胞壁锚定基序(CWA),通过PCR扩增Peno-SP、GFP、CWA的DNA片段并融合,构建强启动子Peno控制表达编码SP-GFP-CWA融合蛋白的DNA片段,将该重组DNA片段连接pSET2载体,获得蛋白表面展示质粒,转化猪链球菌,构建得到以GFP为报告蛋白的猪链球菌蛋白表面展示系统。结果显示,利用猪链球菌的10个LPxTG蛋白及其SP和CWA序列,构建了10个含有Peno-SP-GFP-CWA融合片段的重组pSET2表面蛋白展示质粒pSsPSD1至pSsPSD10,分别转化猪链球菌05ZYH33,PCR鉴定显示其中7个转化猪链球菌。采用western blot初步检测其展示蛋白,结果显示,7个转化阳性菌株均能有效表达GFP蛋白,以成熟GFP条带为指标,均表现出了一定的外源GFP表面展示水平,分别命名为SsPSD1、SsPSD2、SsPSD4、SsPSD7-SsPSD10,其中SsPSD1、SsPSD4、SsPSD8和SsPSD9表面展示水平相对较好,在猪链球菌表面展示外源蛋白方面具有很好的潜力。本研究首次尝试建立猪链球菌蛋白表面展示系统,为猪链球菌表面递呈外源蛋白或抗原提供了新的策略。 相似文献
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CHEN Hua-tao CHEN Xin WU Bing-yue YUAN Xing-xing ZHANG Hong-mei CUI Xiao-yan LIU Xiao-qing 《中国农业科学(英文版)》2015,(6)
Sodium toxicity and potassium insufifcient are important factors affecting the growth and development of soybean in saline soil. As the capacity of plants to maintain a high cytosolic, K+/Na+ratio is t... 相似文献
77.
ZHANG Shao-duo LAI Yi-jun JIANG Hui CHENG Xin-ran YE Yu-ting HE Xi-yu XU Le SONG Bai-fen YU Li-quan CUI Yu-dong MA Jin-zhu 《中国畜牧兽医》2017,44(12):3612-3617
To express CTB-IsdBid-Clfais(CIC) protein and evaluate its immunogenicity, CTB (as a molecular adjuvant) could be tandem linked with IsdBid-Clfais gene by the overlapping PCR method, then CTB-IsdBid-Clfais(CIC) was inserted into pET-32a(+) vector to construct recombinant plasmids pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais. The recombinant plasmids pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais were transformed into Escherichia coli (E.coli) BL21 to express the CTB-IsdBid-Clfa(CIC) protein, the CIC expression protein and its immune activity were detected by Western blotting and ELISA,respectively. The results showed that the length of CIC gene were 2 072 bp, and CIC was correctly inserted into the pET-32a(+) plasmids, the pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais recombinant plasmids were successfully constructed. Western blotting result confirmed that the molecular weight of CIC proteins was 95.9 ku, which were correctly expressed by E.coli BL21 with pET-32a (+)-CTB-IsdBid-Clfais plasmids. ELISA results showed that there was no significant difference among the CIC, IsdBid and Clfais protein groups (P>0.05), and there was extremely significant difference between CIC and BSA protein groups (P<0.01). In conclusion, the pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais recombinant plasmids were successfully constructed, CIC proteins were correctly expressed, and were able to react with serum from mice immunized with IsdBid and Clfais,respectively,therefore, CIC proteins had strong immune activity. 相似文献
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79.
饲粮铜源及水平对育成期雄性水貂生长性能、营养物质表观消化率及氮、铜代谢的影响 总被引:1,自引:0,他引:1
本试验旨在研究饲粮铜源及水平对育成期雄性水貂生长性能、营养物质表观消化率及氮、铜代谢的影响。采用3×3+1双因素试验设计,设3种铜源(硫酸铜、碱式氯化铜、蛋氨酸铜)和3个铜添加水平(10、25、40 mg/kg),1个对照组。选择60日龄健康、体重接近的美国短毛黑雄性水貂120只,随机分成10组,每组12个重复,每个重复1只貂。预试期7 d,正试期45 d。结果表明:1)水貂的平均日采食量随饲粮铜添加水平的增加呈极显著线性增加(P0.01),并且平均日增重随饲粮铜添加水平的增加也呈线性增加(P=0.053)。2)水貂的粗脂肪表观消化率随饲粮铜添加水平的增加呈极显著线性增加(P0.01),并且粗蛋白质表观消化率随饲粮铜添加水平的增加也呈显著线性增加(P0.05)。3)水貂铜摄入量、粪铜排泄量、尿铜排泄量以及铜沉积量均随饲粮铜添加水平的增加呈极显著线性增加(P0.01),然而铜的表观吸收率却随饲粮铜添加水平的增加呈极显著线性降低(P0.01)。水貂对碱式氯化铜和蛋氨酸铜的表观吸收率极显著高于对硫酸铜的表观吸收率(P0.01)。水貂氮沉积量随饲粮铜添加水平的增加而呈显著线性增加(P0.05)。由此可见,基础饲粮中铜含量为8.05 mg/kg时,饲粮添加40 mg/kg的铜能改善育成期雄性水貂生长性能,提高水貂粗脂肪表观消化率;育成期雄性水貂对碱式氯化铜和蛋氨酸铜的表观吸收率高于对硫酸铜的表观吸收率。 相似文献
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使用了三维GIS技术对区域建筑进行虚拟,首先采用ArcGIS to SketchUP6Plugin插件将具有空间参考坐标的广州大学建筑楼的地理数据导入SketchUP,在其中建立带有贴图的精细的广州大学建筑三维模型,最后将三维模型导回Arcscene中进行三维显示及分析。 相似文献