猪IL-2基因的克隆、序列分析及其杆状病毒表达载体的构建

参照GenBank发表的猪IL-2 cDNA基因序列设计1对引物,将猪脾淋巴细胞在伴刀豆球蛋白A(Con A)的刺激下体外培养27 h后,提取激活淋巴细胞总RNA,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆到pGEM-TEasy载体上并测序.测序结果显示,克隆的猪IL-2 cDNA全长为516 bp,开放阅读框(ORF)包含465 bp,编码154个氨基酸,相对分子质量为17 400,等电点为5.27,此cDNA与已报道的猪IL-2同源性为100%.与猫、牛、鸡、犬、鸭、山羊、马、人、家鼠等的IL-2基因进行比较分析,核苷酸同源性分别为83.7%、82.6%、28.2%、80.6%、29.6%、83.4%、81.3%、82.0%和61.5%.将此IL-2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual后获得了重组质粒pFBD-IL2,进而转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用;经抗性及蓝白斑筛选得到了含猪IL-2基因的重组DNA,将其命名为Bacmid-IL2.本试验为进一步在昆虫细胞中表达猪IL-2基因、开发研制新型免疫佐剂奠定了基础.     

罗曼鸡白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。     

天津市北辰区耕地地力评价基础数据处理

以天津市北辰区为例,详细介绍了进行耕地地力评价所需基础数据的处理过程,包括资料的收集整理,图件的配准、数字化以及耕地资源管理单元图的制作与赋值。     

Smad家族成员2/3/4原核表达载体构建和融合蛋白纯化

目的 构建针对Smad家族相关系列原核表达载体,观察其相应蛋白诱导表达纯化情况.方法 PCR扩增Smad2/3/4全长及截短片段,定向插入pGEX-6P-1载体中,构建原核表达重组质粒pGEX-6P-1-Smad2/3/4.经酶切和测序正确后,重组质粒转化表达菌株BL21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达;上清经GST-Sepharose4B亲和纯化,SDS-PAGE考-马斯亮蓝染色鉴定.结果 原核表达载体pGEX-6P-1-Smad2/3/4构建成功,SDS-PAGE证实Smad3A和Smad4存在包涵体,而上清中GST-Smad3(B-D)和GST-Smad2可被纯化.结论 构建的融合蛋白原核表达载体通过诱导和纯化后得到GST-Smad3截断融合蛋白(B-D)和GST-Smad2.     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。     

猪IL-2成熟蛋白在昆虫细胞中的表达及生物学活性鉴定

以含猪IL-2基因的重组质粒pGEM-pIL2为模板,PCR扩增猪IL-2成熟蛋白基因。将猪IL-2成熟蛋白基因定向克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual中,转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含猪IL-2基因的重组质粒rBacmid-IL2,转染昆虫细胞。间接免疫荧光试验表明重组猪IL-2在Sf9昆虫细胞中获得了表达,SDS-PAGE可检测到相对分子质量为20000的重组蛋白,Western-blot证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-2单克隆抗体发生特异性反应,重组猪IL-2经纯化后能明显促进猪T淋巴细胞转化。结果表明,重组猪IL-2在昆虫细胞中得到表达,表达的重组蛋白具有一定生物学活性,为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列(EF552427),设计并合成1对引物.通过常规PCR扩增猪伪狂犬病病毒gE基因,将鉴定正确的gE基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒.以该阳性重组质粒为作为模板建立SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验.结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.999 9,最低检测的拷贝教为35.4拷贝/25 μL,比常规PCR高10倍,特异性和重复性较好并能对样品进行定量检测等优点.本研究成功的建立了检测猪伪狂犬病病毒的SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础.     

一株致仔猪关节炎粪肠球菌的鉴定

对1株分离自关节炎病仔猪的肠球菌进行鉴定。选用常规方法进行染色特性、培养特性观察以及药物敏感性和致病试验,然后利用Vitek-32全自动细菌鉴定系统进行生化特性鉴定,并用PCR方法扩增分离株的16 S rRNA基因,克隆并测序,与GenBank上登录的相关菌株及3个粪肠球菌标准菌株进行16 SrRNA序列比较、同源性分析并构建系统发育树。结果显示,该分离株形态及染色特性与肠球菌一致,对仔猪具有一定的致病性,并对临床常用的7种药物产生了耐受性;Vitek-32生化鉴定和16 S rRNA基因同源性分析及比对结果均显示其为粪肠球菌(E.faecalis)。试验证实了粪肠球菌可导致仔猪关节炎。     

猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR快速鉴定方法的建立

粪肠球菌和屎肠球菌是引起猪感染发病的优势肠球菌种,以肠球菌的16 S rRNA基因设计属特异性引物,利用SodA基因多态性设计种特异性引物,同时优化反应条件,建立了能同时测定猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR方法。通过对来源于猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株进行测定,均能成功扩增出属特异性片段和种特异性片段。经过与快速生化鉴定试剂盒(Vitek-32)和16 S rRNA测序方法比较,多重PCR与16 S rRNA测序方法对猪的临床菌株、粪便菌株和鲜猪肉菌株的鉴定符合率100%;与Vitek-32鉴定符合率为62.3%,其中,与分离于感染猪的临床菌株符合率仅有46.7%,特别是感染猪的屎肠球菌,符合率仅为22.3%。     

鸡新城疫—传染性支气管炎—禽流感(H9N2)三联灭活疫苗的安全性研究

为证实鸡新城疫—传染性支气管炎—禽流感(新支流)三联灭活油乳疫苗的安全性,通过颈部皮下注射接种14日龄来航鸡,每日测定鸡的体重,连续监测28 d,用t检验分析对照组和免疫组体重之间的差异显著性。试验结果表明,免疫接种组和空白对照组体重差异不显著,所制备的新支流三联疫苗不影响鸡的生长性能,对鸡安全。