猪白细胞介素18成熟蛋白基因克隆及在不同原核表达系统中的表达

RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T pIL18,转化E.coli JM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸.将其分别克隆到表达载体pQE30、pET-28a、pGEX6P-1中,构建重组表达质粒pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18.用IPTG诱导表达,重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量分别为19 000、21 000、45 000的重组蛋白.经薄层扫描分析,pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18菌体裂解物分别占菌体总蛋白的17%、28%、27%,均以包涵体形式存在.     

秦皇岛水资源供需平衡预测分析

在全面分析秦皇岛市水资源供需现状的基础上,运用系统动力学方法,建立秦皇岛市水资源系统动力学模型。以2005年为基准年,建立了秦皇岛市水资源供需平衡系统动力学模型对2010年和2020年的水资源供需平衡情况进行了预测分析.根据对模型的灵敏度分析制定了两种方案,从其相互比较中确定了最适合秦皇岛地区可持续发展的方案。从而为秦皇岛地区水资源的供需平衡和水资源可持续利用政策的制定提供一定的科学依据。     

干湿交替和模拟氮沉降对巴音布鲁克高寒湿地土壤CO2排放的影响

为探讨干湿交替和模拟氮沉降对高寒湿地土壤CO_2排放的规律,以新疆巴音布鲁克高寒湿地土壤为研究对象,通过室内模拟控制试验,研究水分变化下[100%、70%、50%、40%和25%WFPS(土壤充水孔隙度Water filling soil porosity)]氮添加N0(0 kg·hm~(-2)·a~(-1))、N10(10 kg·hm~(-2)·a~(-1))和N100(100 kg·hm~(-2)·a~(-1))处理对巴音布鲁克高寒湿地土壤CO_2排放的影响。研究结果表明:土壤CO_2排放速率及累积排放量随WFPS值及氮添加量的增大而增加。一个循环,土壤由干到湿的过程中,初期土壤CO_2排放速率最高,随后随着水分减少,土壤CO_2排放速率呈降低趋势;首次干湿循环土壤CO_2累积排放量最大。土壤TN、NO_3~--N、NH_4~+-N、SOC含量均随土壤水分和氮添加量的增加而增加,而土壤SON随土壤水分和氮添加量的增加而减少。水分与土壤CO_2排放速率呈极显著正相关,氮添加与CO_2排放亦呈正相关。除了土壤SON、SOC含量与土壤CO_2排放速率呈负相关关系外,土壤TN、NO_3~--N、NH_4~+-N与CO_2排放都呈现出正相关关系。     

紫花苜蓿抗热性鉴定与评价的研究进展

紫花苜蓿Medicago sativa因其营养丰富被广泛栽培,已成为草食家畜和奶牛养殖业的重要饲草,更是一种重要的生态改良草,在我国畜牧业发展和生态保护中起着不可比拟的作用。高温是影响紫花苜蓿生长的重要限制因子,研究发现高温胁迫致使植物发生一系列生理、生化及形态上的响应。在河南省,由于夏季高温的胁迫,致使紫花苜蓿夏眠,甚至死亡,严重影响其品质和产量。结合植物自身的调节机制,从植物形态及抗氧化系统综合阐述了高温条件下紫花苜蓿的抗热性鉴定方法和评价指标,旨为其抗热性鉴定和选育工作提供一定的科学参考。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因与鸡IL-18基因重组禽痘病毒的构建

将含痘病毒启动子LP2EP2的鸡传染性支气管炎病毒S1糖蛋白基因和鸡IL-18(ChIL-18)基因同时插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组禽痘病毒转移载体pSYS1/ChIL-18。用脂质体将其转染已感染禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达S1和鸡IL-18的重组禽痘病毒(rFPV-S1-ChIL-18)。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选,对重组病毒rFPV-S1-ChIL-18进行多次蚀斑克隆。以重组禽痘病毒DNA为模板,利用S1基因和鸡IL-18基因特异引物进行PCR,分别扩增出1条约1.7 kb和1条约0.6 kb的带。经间接免疫荧光法和T细胞转化试验证实感染rFPV-S1-ChIL-18的CEF中存在表达的S1和鸡IL-18。     

人β2微球蛋白成熟肽基因克隆及其原核表达载体的构建

根据GenBank基因库中人β2微球蛋白(β2m)成熟肽基因序列设计2对引物,使用RT-PCR法从健康人血液中扩增人β2m成熟肽基因,扩增产物进行T-A克隆和测序.结果表明,获得的人β2m成熟肽基因为297 bp,与模板序列的同源性为100%.利用基因重组技术,将β2m成熟肽基因亚克隆入pET-28a(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET-28/Humβ2m中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET-28/Ham β2m.     

多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因、猪细小病毒(PPV)的VP2基因序列和猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2基因序列,设计合成了3对特异引物,分别建立了PRV,PPV和PCV2的单项PCR诊断方法;通过对扩增条件的筛选,建立了PRV,PPV,PCV2的复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增PRV的355 bp,PPV的195 bp和PCV2 487 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)扩增结果均为阴性,对PRV,PPV,PCV2的最低检出量分别为100 fg,1 pg和10 pg的DNA.该方法适合对PRV,PPV和PCV2的联合检测和鉴别诊断.     

贵宾犬α-干扰素基因的扩增、克隆与序列分析

参照基因库中收录的犬α-干扰素基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从贵宾犬肝组织基因组DNA中扩增IFN-α基因,将回收得到的特异性片段克隆于pGEM-T Easy载体中,转化感受态细胞DH5α,经蓝白斑筛选,质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性重组质粒,测定其核苷酸序列。测序结果表明,贵宾犬α-干扰素基因全长为564 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸。用DNAStar软件将所得序列与人和其他种动物的IFN-α基因进行核苷酸及氨基酸同源性比较,并通过绘制系统进化树可知,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。     

Porcine Interleukin-2 Expression in Insect Cells and Its Enhancement of Pig Immunity to Swine Influenza Virus Inactivated Vaccine

Mature porcine interleukin-2 （pIL-2） gene was amplified by PCR from the plasmid pGEM-T-pIL2 and cloned into the baculovirus pFastBacTM Dual vector of the Bac-to-Bac baculovirus expression system under the control of the PH promoter. Recombinant plL-2 （rpIL-2） expressed in Sf9 insect cells was detected by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and immunofluorescence assay. Western blot analysis confirmed that the rpIL-2 protein had a molecular mass of 20 kDa, which was larger than the molecular mass of the mature protein predicted based on its peptide sequence. The rpIL-2 protein induced in vitro proliferation of ConA-stimulated porcine splenocytes and enhanced in vivo protective immune responses induced by vaccinating the pigs with inactivated oil emulsion vaccine against swine influenza virus. The results showed that the rpIL-2 expressed in Sf9 insect cells has immunoenhancement effects; the finding lays the foundation for the preparation of a specific recombinant IL-2 protein and the development of a novel immune adjuvant of vaccines against various infectious porcine pathogens to increase the immunoprotective efficacy of vaccines.