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181.
二温式PCR检测对虾白斑综合征病毒 总被引:18,自引:0,他引:18
本研究设计了一对能扩增大小为306bp对虾白斑综合征病毒(WSSV)某段基因的特异性引物,优化建立了能快速检测WSSV的二温式PCR,在对包括105份临床样品、10份SPF南美白对虾组织样品和其他对虾病害病原在内的样品检测结果中,有65份临床样品呈现WSSV阳性,而10份SPF南美白对虾组织样品和其他对虾病害病原的PCR结果为阴性。该二温式PCR最低能检测到1pg的WSSV感染对虾组织样品总DNA。这些结果表明,该PCR具有高度的特异性和敏染性。 相似文献
182.
183.
应用聚合酶链反应检测鉴别火鸡支原体方法的建立 总被引:8,自引:0,他引:8
根据基因库中火鸡支原体(MM)16S rRNA基因序列(Genebank U04649),设计了一对跨幅为850bp的引物,用这对引物对4禽侏火鸡支原体标准菌株和6种其它禽病病原体进行PCR扩增,结果4禽株鸡支原体菌株均得到片段大小与预期设计相一致的850bp的PCR扩增产物,而其它6种禽病病原体(包括MG、MS和MI)的扩增结果则均为阴性,该PCR能检出100fg的火鸡支原体的DNA模板。 相似文献
184.
185.
186.
本研究利用PCR方法扩增出Ⅰ群禽腺病毒FAVⅠhexon基因主要抗原区,连接于表达载体pGEX-4T-1中,构建成重组质粒pGEX-hexon,并转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达,对表达的Hexon蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果显示,试验成功扩增获得hexon基因主要抗原区序列,大小为1020bp。重组蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白大小为63.1ku,与预测值相符。经Western-blot分析,表明重组蛋白与FAVⅠ的阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性,为FAVⅠ诊断试剂盒的研制奠定基础。 相似文献
187.
鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立 总被引:1,自引:0,他引:1
根据鸡传染性贫血病毒基因组保守区域设计1对扩增片段为164 bp的特异性引物,应用SYBR GreenⅠ染料建立了鸡传染性贫血病毒(CIAV)荧光定量PCR检测方法.以本室构建的阳性重组质粒作为模板,制定标准曲线,对CIAV阳性样品进行了敏感性、特异性和重复性、稳定性试验,并应用于临床检测.结果表明引物最佳终浓度为0.2 μmol/L,制作的标准曲线定量浓度范围宽,最低可检测到每个反应相当于10个拷贝的标准品DNA;与IBDV、ARV、MG都不反应;重复性、稳定性试验的变异系数都较小.对保存的25份疑似CIAV样品进行荧光定量PCR检测,结果检出9份阳性.本研究建立的荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染CIAV的检测. 相似文献
188.
针对当前对虾(Penacus orientalis)养殖业亟需研究开发一种简便快速、敏感特异的检测技术来实现对对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)进行检测监控的现状,本研究根据WSSV基因组ORF120保守区序列,设计合成6条环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)特异性引物,分别为外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LF/LB。利用钙黄绿素/氯化锰作为检测指示剂,通过对反应条件优化,建立了可视化WSSV-LAMP检测方法。在检测中未发生扩增反应时,钙黄绿素被氯化锰螯合,呈淬灭状态。当样品中有WSSV靶基因存在时,大量DNA被合成,并产生同样大量的焦磷酸根离子,此时焦磷酸根离子竞争性与Mn2+结合,形成稳定的不溶性焦磷酸盐沉淀,钙黄绿素被释放而发出肉眼可见的黄绿色荧光。该扩增一次性反应约60min即可完成对待检样品的检测。经测定,本方法能特异性地检测出阳性样品中的WSSV目的基因,并能通过扩增产物所产生的黄绿色变化与阴性样品区别;本技术对目的基因的最低检测量为1fg。在临床检测试验中,WSSV-LAMP与世界动物卫生组织(OIE)推荐的WSSV-PCR检测方法均能从250份对虾样品中,同时检测到15份编号相同的阳性样品,符合率达100%。除此之外,WSSV-LAMP还能从另外3份PCR检测为阴性的样品中检测到目的基因。比较这两种方法的阳性检出率,WSSV-LAMP为7.2%(18/250),WSSV-PCR为6.0%(15/250),WSSV-LAMP对自然感染的临床样品阳性检出率要比WSSV-PCR高。说明WSSV-LAMP在病毒含量较低的临床样品检测中比OIE推荐的PCR方法具有更高的技术优势,能在对虾养殖生产上的临床诊断、育种及口岸检疫,甚至海洋生态监测中对WSSV进行现场检疫。 相似文献
189.
33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒(fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ)的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。 相似文献
190.
二温式PCR检测对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
根据对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)基因序列,设计了1对可以扩增356 bp IHH-NV某段基因序列的特异性引物,优化建立了能快速检测IHHNV的二温式PCR。特异性试验和敏感性试验结果表明,该技术只对IHHNV DNA模板进行扩增,得到356 bp的DNA扩增片段,而对SPF南美白对虾组织DNA和其它对虾病原DNA/RNA的扩增结果为阴性;该技术最低能检测到10 pg的IHHNV感染对虾组织样品总DNA。应用该技术对400份对虾临床样品进行检测,结果有96份样品呈现阳性,表明该病在我国南方的养殖对虾中广泛存在,二温式PCR技术可以直接用于该病的临床快速检测和流行病学调查。 相似文献