向日葵黑茎病菌RPA/CRISPR-Cas12a快速检测方法的建立

向日葵黑茎病菌是向日葵上的一种毁灭性真菌,是我国的植物检疫性有害生物。为了准确快速检测向日葵黑茎病菌,本研究根据向日葵黑茎病菌及其近似种的ITS序列差异,设计特异性RPA引物和CRISPR-Cas12a crRNA,建立了RPA等温扩增技术结合CRISPR-Cas12a检测的快速检测方法。通过条件优化,RPA/CRISPR-Cas12a检测体系在37℃恒温条件下,RPA反应30 min,CRISPR/Cas12a反应20 min,即可特异性检测向日葵黑茎病菌。荧光法检测灵敏度与实时荧光PCR的灵敏度相当,最低检测量为0.1 pg,试纸条法检测最低检测量为1 pg。由于试纸条检测结果可用肉眼观察,快速便携,操作简单,更适合用于田间和口岸的向日葵黑茎病菌快速早期检测;而荧光检测灵敏度高,对环境要求高,更适合用于实验室检测。     

2009-2019年中国进口大豆中检疫性有害生物截获情况分析

大豆是中国进口量最大的农产品,因此其携带有害生物风险很高.为提高进口大豆中检疫性有害生物的截获能力,给进口大豆检疫工作及其他相关工作提供参考,本研究统计分析2009-2019年全国口岸进口大豆基本情况,比较分析不同来源国(或地区)大豆中截获杂草、昆虫、真菌等检疫性有害生物的种类数和种次数.结果显示:2009-2019年中国大豆进口量整体呈逐年上升的趋势,2017年大豆进口量达到最大;大豆中截获的检疫性有害生物共136种,包括杂草84种、昆虫24种、真菌14种、病毒8种、细菌3种、线虫2种和软体动物1种.在所截获检疫性有害生物中,疫情问题最突出的是杂草,检出种次数最多的3种杂草分别是假高粱(及其杂交种)、豚草和刺蒺藜草;检疫性昆虫检出种次数最多的是四纹豆象;检疫性真菌检出种次数最多的是大豆北方茎溃疡病菌;检疫性病毒检出种次数最多的是菜豆荚斑驳病毒.从疫情来源国来看,巴西、美国、阿根廷是截获检疫性有害生物种类及种次数最多的3个国家,其中巴西大豆以杂草、昆虫及真菌疫情为主,美国大豆以杂草、真菌及病毒疫情为主,阿根廷大豆以杂草和真菌疫情为主.     

番石榴黑斑病病原菌的分离鉴定

[目的]从送检番石榴样品上发现一种黑斑病,对病原真菌进行分离鉴定,以明确其分类地位及重要性。[方法]通过致病性测定、形态学观察和ITS序列分析对病菌进行了鉴定。[结果]形态学观察和ITS序列分析表明,病原菌为芒果球座菌（Guignardia mangiferae）。[结论]引起番石榴黑斑病的病原菌为芒果球座菌（G.mangiferae）。此前还未有G.mangiferae引起番石榴病害的报道。     

逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒

 根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了4组RT-LAMP引物,通过引物筛选试验,确定SB1组引物为最佳引物,并进行了引物特异性与灵敏度检测试验,最终建立了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。灵敏度检测试验显示,RT-LAMP方法比普通RT-PCR法灵敏度高10倍,而检测时间明显缩短,整个反应过程只需40 min。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可裸眼观察颜色变化来判定结果。本研究所建立的SBMV RT-LAMP方法具有快速、稳定、灵敏、特异、操作简单的特点,适合于SBMV的现场快速检测。     

从荷兰番红花种球中截获的次薄滑刃线虫的检疫鉴定

宁波口岸从荷兰番红花种球中分离到大量滑刃属线虫活虫,该荷兰群体的主要形态特征为:雌虫尾呈亚圆柱形,尾端半圆形,尾端腹侧有尾尖突长1.5~3.0μm;后阴子宫囊显著,长89.3~118μmm;侧线3条。基于28S、ITS和18S基因DNA序列构建NJ系统发育进化树显示该荷兰群体与次薄滑刃线虫亲缘关系极近且在同一进化分支中。通过形态特征和DNA序列分析,鉴定该荷兰群体为次薄滑刃线虫(Aphelenchoides subtenuis Cobb,1926)。     

东亚型和欧洲型拟松材线虫的形态学和ITSPCR-RFLP鉴定

对宁波口岸截获的不同来源木质包装中的东亚型和欧洲型拟松材线虫进行形态学和ITSPCR-RFLP研究。选用5种限制性内切酶RsaI,HaeⅢ,MspI,HinfI,AluI对各株系单条线虫ITS区PCR扩增产物进行酶切,发现限制性内切酶RsaI有3种酶切结果,表明ITS区段存在DNA序列异质性。研究再次证明ITSPCR-RFLP不但是伞滑刃线虫鉴定十分可靠的辅助手段,还可有效区分种内不同地理型。对拟松材线虫与松材线虫(包括"M"型和"R"型株系)、豆伞滑刃线虫、伪伞滑刃线虫等近似种的区别进行讨论。     

苹果茎沟病毒KRL-1分离物外壳蛋白基因序列测定

以KRL-1(库尔勒香梨分离物)总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增外壳蛋白(CP)基因的cDNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定,分析结果表明:KRL-1CP基因由714个核苷酸组成,编码237个氨基酸。KRL-1与ASGV其它分离物CP基因的核苷酸同源性为90%-93%,氨基酸同源性为94%-98%。根据KRL-1与其他分离物CP基因序列和生物学症状上的差异,可推断KRL-1存在较大的分子变异。     

进境美国大豆夹杂向日葵茎溃疡病菌的检疫鉴定

向日葵茎溃疡病菌是我国进境植物检疫性病原真菌。自进境美国大豆夹杂的向日葵种籽上,采用常规平板法分离并纯化获得1株疑似向日葵茎溃疡病菌Diaporthe helianthi菌株8616S3。形态学特征观察表明,该菌株在PDA上产生大量分生孢子器和β型分生孢子,但未见有性阶段。经rDNA ITS基因序列比对分析,发现该菌株与GenBank中多个向日葵茎溃疡病菌菌株的ITS基因序列同源性达99%以上,位于同一个分支。致病性测定结果表明,该菌株可侵染向日葵茎部,引起典型向日葵茎溃疡病症状。美国是我国主要大豆进口来源国,这是我国首次从进境美国大豆夹杂物中截获向日葵茎溃疡病菌D.helianthi。     

基于TaqMan MGB探针的葡萄茎枯病菌实时荧光PCR检测方法

 葡萄茎枯病菌是我国进境植物检疫性有害生物。带菌植物材料是病害传播的重要载体,准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行口岸检疫措施及研究病害防控措施的有力工具。根据葡萄茎枯病菌及其近似种的细胞骨架蛋白(Actin)基因序列差异,设计并合成1对引物和1条特异性TaqMan-MGB探针,建立了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR检测方法。通过对反应体系的优化,确定了葡萄茎枯病菌的实时荧光PCR最佳反应条件:引物终浓度为0.6 μmol·L^-1,探针终浓度为0.6 μmol·L^-1。灵敏度试验结果显示,最低检测限为总DNA含量20 pg(20 μL反应体系)。此方法快速灵敏,整个反应1 h即可完成,检测过程完全闭管,无需PCR产物后续处理,为快速检测葡萄茎枯病菌提供了重要参考。该方法用于口岸疑似菌株检测,可成功检测出葡萄茎枯病菌。本研究建立的基于TaqMan MGB探针的荧光定量PCR检测方法为葡萄茎枯病菌的早期快速检测监测提供了有力工具。     

木质包装中松材线虫的实时荧光PCR检测

松材线虫是进境木质包装中的重要检疫对象之一。本研究以进境木质包装中截获的12种伞滑刃属线虫,包括4种不同来源的松材线虫、3种不同来源的拟松材线虫、豆伞滑刃线虫、大尖尾伞滑刃线虫、阿苏里伞滑刃线虫、伯氏伞滑刃线虫及拟小刺伞滑刃线虫为材料,进行实时荧光PCR检测。结果显示,仅松材线虫可观察到明显的荧光强度变化,而其他线虫的荧光强度没有变化。通过研磨样品的方法,提取单条松材线虫的DNA,进行实时荧光PCR试验,检测成功率为100%,且不论是雄虫、雌虫或幼虫均能检测出来。该研究对于我国口岸进境木质包装中松材线虫的检测具有一定的实际意义。