云南2株H4N6亚型禽流感病毒株的分离与鉴定

采集家禽喉气管作为检测样品,用甲型流感病毒M基因检测引物进行RT-PCR检测,确定样品为甲型流感病毒感染。用已建立的PCR法检测H5、H9亚型及新城疫结果为阴性。在9日龄鸡胚中进行病毒分离培养,收集48 h后死亡鸡胚尿囊液进行血凝和血凝抑制试验,有血凝效价但不能被H5、H7、H9和新城疫阳性血清抑制。为进一步确定病毒的亚型,用甲型流感病毒血凝素基因通用引物进行RT-PCR扩增、克隆及测序,将测得的HA基因序列与血凝素亚型标准序列进行比对,同源性为34.9%～87.3%,与H4亚型的同源性为87.3%;设计神经氨酸酶基因测序引物,将所测序列与神经氨酸酶亚型标准序列进行比对,同源性为47.7%～90.8%,与N6亚型的同源性高达90.8%。通过进行HA和NA基因序列比对,可以确定试验所分离到的2株甲型流感毒株为H4N6亚型禽流感病毒。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）北美型毒株和欧洲型毒株N蛋白基因保守序列,设计1对特异性引物和1条探针,以ABI公司PRRSV RNA为标准品,优化了PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测方法,25μL反应体系引物prrsv-f/prrsv-r（20μmol/L）各0.5μL,探针prrsv-p（10μmol/L）0.5μL为反应最佳工作浓度,标准曲线Ct值和模板启始浓度的log值之间具有良好的线性相关性。特异性、敏感性和重复性检测结果显示,该方法能特异的检测PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株,与其他主要猪病病原检测无交叉反应;针对PRRSV RNA标准品检测,灵敏度可以达到10拷贝;重复性检测Ct值变异系数为0.74%～1.52%。用建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法,对40份临床样品检测,与商品化试剂盒检测结果完全一致。     

云南多重耐药猪源大肠杆菌的分离鉴定及其耐药机制初步研究

从云南省3个规模化猪场仔猪黄白痢病猪病例分离到7株革兰氏阴性小杆菌,用生理生化鉴定、药敏试验和致病性试验对分离菌株进行鉴定,并提取细菌的质粒,分析质粒与细菌耐药性之间的相关性。结果表明:7株分离株经生理生化试验鉴定为仔猪黄白痢大肠杆菌,对小白鼠有强致病性,分离株对15种抗生素表现为多重耐药,其中14耐1株、13耐2株、11耐2株、8和8耐以下2株,头孢类抗生素是治疗仔猪黄白痢的首选药物,表明云南猪大肠杆菌已经呈现出十分严重的耐药性。质粒图谱分析表明,4株分离株均携带分子量约为5000bp的一个质粒,而另外3株不携带任何质粒。质粒转化实验表明,分离株所携带的质粒为非耐药性质粒,与细菌耐药性无直接相关性。     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其荚膜血清型鉴定

从病死母猪肺脏中分离到一株革兰氏阴性小杆菌,用生理生化鉴定、药敏试验、致病性试验和PCR鉴定方法对分离菌株进行鉴定,并用多杀性巴氏杆菌荚膜分型引物对分离株的荚膜血清型进行鉴定。结果表明:本菌为猪多杀性巴氏杆菌,对多种抗生素高度敏感,对小白鼠有强致病性;PCR扩增16SrDNA基因获得1415bp片段,分离株的16SrDNA核苷酸序列与多杀性巴氏杆菌(AY078999)的同源性为99%,因此该分离菌株被鉴定为致病性巴氏杆菌,命名为YN20110122株;本菌分离株为荚膜A型血清型多杀性巴氏杆菌。     

蓝舌病1型病毒VP2蛋白的原核表达及免疫反应性分析

试验旨在研究蓝舌病1型病毒（bluetongue virus serotype 1,BTV-1） VP2蛋白体外表达产物免疫反应性。根据已发表的BTV-1 Y863毒株L2基因序列设计合成特异性BTV-1 PCR引物,通过RT-PCR方法扩增L2基因,将纯化的L2基因克隆至pEASY-Blunt E1表达载体,对重组质粒进行鉴定,将阳性重组质粒L2克隆至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行表达,对获得的纯化的BTV-1 VP2重组蛋白进行Western blotting、ELISA、阻断ELISA分析。结果显示,BTV-1 VP2蛋白在pEASY-Blunt E1载体上以包涵体形式表达,通过Ni-NTA亲和层析,160和200 mmol/L咪唑是洗脱BTV-1 VP2蛋白表达产物的最佳浓度。纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的BTV-1 VP2重组蛋白,分子质量约105 ku,Western blotting、ELISA、阻断ELISA结果显示,重组BTV-1 VP2蛋白能与BTV-1型特异性抗体发生特异性结合,且此结合能被BTV-1阻断。本试验结果表明,通过原核表达载体pEASY-Blunt E1表达的BTV-1 VP2重组蛋白具有良好的免疫反应性,为BTV-1 VP2蛋白型特异性表位定位研究奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒NP基因的克隆与表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒NP基因序列设计、合成PCR克隆引物。自H5N1阳性病料中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶,经PCR扩增NP基因,采用Invitrogen定向表达系统进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组NP蛋白,分子质量约66.0ku。采用单克隆抗体和阳性血清经ELISA、免疫印迹分析重组蛋白的免疫反应性。结果表明:所获得的重组NP蛋白在ELISA分析中均能与阳性血清和单克隆抗体发生特异性结合,但在免疫印迹分析中仅与阳性血清发生特异性结合。     

云南牟定狂犬病诊断及病毒部分N基因测序

自英国引进3株荧光素标记的针对狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体,建立狂犬病直接免疫荧光诊断技术。根据已知狂犬病毒核蛋白(N或NP)基因序列,设计合成4对引物,建立狂犬病RT-PCR及套式PCR诊断技术。自牟定采集发病犬脑组织样品15份,免疫荧光及PCR诊断结果均为阳性。对PCR产物进行纯化后,克隆至pMD18-T载体测序(基因库登录号:EU095330),并与已知代表毒株对应序列进行比对及系统发育分析,结果表明:云南牟定狂犬病毒属于基因1型和血清1型毒株,与2006年广西发病犬分离毒株遗传关系密切,病毒部分N基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为97.4%和99.0%。     

新城疫免疫失败原因浅析

新城疫是由新城疫病毒引起的一种高度接触性传染病,主要侵害鸡和火鸡,其他禽类和野禽也能感染,亦可感染人.本病常呈败血症经过,其特征是呼吸困难、下痢和神经症状.主要病理变化为黏膜和浆膜出血,腺胃黏膜出血具有诊断意义.尽管通过免疫接种、免疫监测和综合防制措施控制了该病的大规模、毁灭性流行,但是并没有使新城疫得到根本控制.     

云南边境Asia 1型口蹄疫监测及病毒vp1基因序列比较

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的主要侵袭偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病。口蹄疫病毒存在7个不同血清型,病毒VP1蛋白抗原性差异是病毒血清型划分依据,而其编码基因核苷酸序列差异是同型病毒Topotype型或基因型划分依据。采用RT-PCR及O／A／C／Asia1多重RT-PCR技术,对2006年期间自云南边境地区采集境外流动动物组织样品120份,进行口蹄疫病原监测,检出Asia1型口蹄疫病毒阳性样品7份。对阳性样品中病毒vp1基因全序列进行扩增、纯化后,克隆至pMD18-T载体测序,并与已知代表性毒株进行比对及系统发育分析。结果发现：云南边境Aisa1型口蹄疫病毒阳性样品vp1基因核苷酸序列同源性介于83．4％～99．5％,不同分离毒株以15％序列差异作为分型标准,存在1个新拓朴型或基因型V,且与已知的4个拓朴型或基因型不同。系统发育分析确定了1个新的遗传谱系Ⅶ。部分VP1蛋白表位关键性氨基酸位点存在变异。     

土杂鸡H9亚型禽流感和传染性喉气管炎混合感染的诊断

为了诊断昆明市某土杂鸡(阉鸡)养殖场疫病类型,采集病鸡喉气管、肺脏、脾脏等组织样品,混合研磨后提取病原核酸,通过RT-PCR对新城疫、禽流感、H5亚型禽流感、H9亚型禽流感、传染性支气管炎、传染性喉气管炎等家禽呼吸系统疫病病原核酸进行检测。检测结果为禽流感、H9亚型禽流感和鸡传染性喉气管炎病原核酸阳性,诊断该病例为H9亚型禽流感和传染性喉气管炎混合感染所致。