C型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及重组蛋白的纯化

利用PCR技术扩增获得C型口蹄疫病毒VP1基因,将其克隆到原核表达载体pET-30α(+)上,构建重组表达质粒pET-VP1。质粒pET-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导VP1基因的表达,收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE、Western blot分析,结果得到分子量约为33 ku的目的条带,表达产物占菌体总蛋白的35%,且该目的条带能被C型FMDV阳性血清识别,说明VP1基因在大肠杆菌中得到高效表达。融合表达蛋白经镍柱纯化,重组蛋白纯度达90%以上。     

口蹄疫病毒致病机理研究进展

利用经典的生物化学和物理分析手段来研究感染口蹄疫病毒(FMDV)的细胞能揭示FMDV各个蛋白的结构和功能,而通过对FMDV遗传差异的研究可知病毒蛋白的正确结构在病毒的复制和致病中起着重要作用。近年,利用基因工程的方法研究人员可直接验证FMDVRNA结构、编码区和多聚蛋白在FMDV复制和致病的相关推测。     

猪口蹄疫病毒受体β8亚基的基因克隆与分子特征

口蹄疫病毒利用整联蛋白作为病毒受体进入宿主细胞。本试验在国际上首次从口蹄疫病毒感染猪的舌皮组织中克隆到了β8亚基基因,并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪β8亚基基因的编码区含有2 304个核苷酸,编码767个氨基酸,其中信号肽由42个氨基酸组成,胞外域由637个氨基酸组成,含有7个潜在的糖基化位点(NXT/NXS)和49个半胱氨酸残基,跨膜区由30个氨基酸组成,胞浆域由58个氨基酸组成,猪β8基因与牛、人、犬、猕猴、家鼠和挪威大鼠的β8基因核苷酸序列同源性分别为94.3%、91.4%、91.7%、91.4%、83.5%、83.5%,推导的氨基酸序列同源性分别为95.0%、91.8%、92.8%、91.5%、84.0%、84.8%。猪与牛β8亚基同源性最高。猪β8亚基存在复杂多变的二级结构,其中1-42、680-709位氨基酸区段疏水性较强,形成表面蛋白结构的可能性较小,分别是该亚基的信号肽和跨膜区。本试验为进一步深入研究β8亚基在口蹄疫感染过程中所扮演的角色奠定了基础。     

口蹄疫病毒株OA/58 L蛋白酶的结构构建和功能分析

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR I酶切法鉴定。该毒株与A12,O1K,O1Campos和TW45/97毒株序列通过对比分析发现,L基因中有2个起始密码子,第二个是首选;并且确定氨基酸保守区主要位于第35～39,43～54,65～67,75～80,90～111,113～142,144～146,148～157,159～172和176～187位。L蛋白酶含有球状区域,碳端有一柔性杆状结构。合成的L蛋白酶可形成二聚体结构。第144位的Lys、148位的His和163位的Asp可能是L蛋白酶的活性位点。保守区氨基酸残基在维持蛋白的空间构像和功能方面具有重要作用。由拉马钱德兰图可证明本试验构建L蛋白酶的空间结构是合理的,它对于进一步的研究具有指导性。     

沙门菌载体重组疫苗的研究进展

目前,大多数疫苗都采用皮下或肌肉注射,可以诱导有效的血清免疫,但通常无法诱导黏膜抗体(sIgA)的产生.皮下或肌肉注射导致动物产生较大的应激反应,采食量下降,影响动物生长繁殖.实际生产中的不规范免疫操作可能导致病原微生物在个体间的人为传播而引发疾病.     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测(英文)

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33Ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

病毒调控宿主免疫反应的研究进展

病毒感染宿主后，针对宿主免疫反应的特点和薄弱环节，形成了多种方式拮抗宿主的免疫防御。论述了病毒抑制体液免疫及其抑制或调节细胞因子活性的过程和方式，旨在从分子水平上阐明病毒逃避免疫应答的机理。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3C真核表达载体的构建及表达

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起,属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属[1 2],为单链正股RNA[3]。T racey认为3C蛋白酶具有病毒加工、宿主蛋白裂解的作用[4]。H ata认为在感染FMDV的宿主细胞内翻译的一条多肽链,11个蛋白酶裂解位点中,9个位点由3C蛋白酶完成裂解过程[5]。目前,对同     

偶蹄家畜FMDV受体通用亚基αv基因的分子特征及其进化关系

已发现至少有αvp1、αve3、αvB6、αvp84种整联蛋白是FMDV的细胞受体,αv是4种受体的通用亚基。本试验中从FMDV实验感染猪和牛、健康羊和双峰驼等的肺组织中克隆到了受体通用亚基αv基因,并对其序列进行了比较和进化关系分析。结果显示,羊、牛、猪、双峰驼的αv亚基基因的编码区分别含有3147、3147、3141、3165个核苷酸,分别编码1048、1048、1046、1054个氨基酸,信号肽均由氨基端30个氨基酸组成,跨膜区、胞浆区均分别由29、32个氨基酸组成;胞外区分别由957、957、955、963个氨基酸组成。羊、牛、猪、双峰驼αv亚基基因在Gen—Bank中的登录号分别为EU367989、DQ871215、EF474019、EU367990。同源性分析表明,信号肽变异最大,胞外区次之,跨膜区和胞浆区比较保守;进化树表明,与灵长类、啮齿类、奇蹄类、禽类、食肉类等口蹄疫非易感物种相比,口蹄疫易感动物羊、双峰驼、猪、牛等偶蹄家畜αv亚基的亲缘关系较近,处于同一进化分支。这表明受体αv亚基可能与FMDV的宿主范围和组织嗜性有关。     

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.