I群禽腺病毒间接33K-ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种鉴别I群禽腺病毒（FAVI）灭活苗免疫和野毒感染的检测方法,为FAVI的防控与净化提供技术支撑。【方法】以FAVI 33K重组蛋白为包被抗原,筛选和优化间接ELISA的条件,建立FAVI抗体的间接33K-ELISA检测方法,检验其特异性、敏感性和重复性,并鉴别检测FAVI活病毒感染血清和灭活苗免疫血清各50份。【结果】33K重组抗原最佳包被浓度6.0 μg/mL,包被条件为37℃孵育1 h后4℃过夜,最佳封闭液为5%脱脂奶,封闭时间1.0 h;待检血清稀释度1∶100,抗原抗体最佳作用时间1.0 h;酶标二抗最佳稀释度1∶3000,作用时间45 min。优化后的间接33K-ELISA的阴、阳性临界值为0.316。其特异性、敏感性、重复性试验及鉴别检测结果表明,优化后的间接33K-ELISA具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,且能成功鉴别FAVI感染与灭活疫苗接种。【结论】间接33K-ELISA操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好、适于批量检测,可有效鉴别FAVI感染和灭活苗免疫接种,利于挑选出FAVI感染动物,为FAVI的防控与净化提供了新思路和新方法。     

鸡毒支原体弱毒F株与强毒株二重荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

研究根据基因库中鸡毒支原体(MG)S6毒株和F株的基因保守序列,设计了2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的二重荧光定量PCR检测方法,与其它禽类呼吸道病原体无交叉反应,对MG模板的灵敏度检测限为10拷贝/μL,对MG强弱毒模板以不同的浓度进行组合,仍可有效地检测到毒株,批内和批间重复变异系数小,特异性强、灵敏度高、稳定性好。研究建立的二重荧光定量PCR方法可用于MG强、弱毒株的鉴别检测,为该病的防控与净化提供良好工具。     

鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank中鸭新城疫病毒(NDV)的F基因和鸭圆环病毒(DuCV)的V1/rep基因的保守序列,各设计一对特异性引物,并对二重PCR的扩增条件进行优化,建立了鸭NDV和DuCV的二重PCR检测方法。对混合样品进行扩增,得到2条大小为493bp(鸭NDV)和218bp(DuCV)的特异性条带,与预扩增片段相符。而对番鸭细小病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭源小鹅瘟病毒、鸭H9亚型流感病毒、鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌等病原检测,结果为阴性。该方法的敏感性试验表明,鸭NDV的核酸最小量为40fg,DuCV为20fg。     

H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速、特异、敏感的H6亚型禽流感病毒(AIV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。针对H6亚型AIV的血凝素(HA)基因序列保守区设计1对引物,并优化反应条件。结果表明,该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出1 000倍;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(80.81±0.08)℃,组内变异系数为0.08%～0.99%,组间变异系数为1.85%,可重复性好;对H1、H3、H5、H7、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒等其他呼吸道病原体无扩增;检测快速,从样本处理到报告结果仅需3.5 h。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种快速检测鸭Ⅰ型肝炎病毒(DHV I)的方法,本研究根据基因库中DHV Ⅰ基因的保守序列,设计特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了DHV I的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10fg,高于常规PCR方法 100倍;全部反应可在1 h内完成;可以通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸭常见病原体的检测结果均为阴性。实验结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于DHV Ⅰ感染的快速检测。     

牛病毒性腹泻病毒E2基因在昆虫细胞中的表达

为了获得具有良好抗原性的牛病毒性腹泻病毒E2囊膜蛋白,利用PCR方法扩增牛病毒性腹泻病毒E2基因,连接于昆虫杆状病毒表达载体中,构建pFastBacHTA-E2重组质粒.将该重组质粒转化入DH10BAC感受态细胞,经PCR鉴定获得转座杆粒Bacmid-E2.转座杆粒Bacmid-E2转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,感染细胞后,收获得到目的蛋白,用SDS-PAGE和Western blot对重组的表达蛋白进行分析.结果表明,重组E2蛋白大小为43.6 ku,与预期值相符,该蛋白能与牛病毒性腹泻病毒阳性血清发生特异性反应,为进一步研发牛病毒性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒奠定基础.     

鸭源新城疫病毒、鸭瘟病毒和鸭圆环病毒三重PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测鸭源新城疫病毒(DuNDV)、鸭瘟病毒(DPV)和鸭圆环病毒(DuCV)的方法,根据DuNDV、DPV和DuCV基因的保守序列设计了3对特异性引物,预特异扩增DuNDV片段大小为823 bp,DPV为576 bp和DuCV为338 bp.经过反应条件的优化,建立了DuNDV、DPV和DuCV的三重PCR检测方法.该方法特异性好,对鸭的其他病原检测结果为阴性;敏感性高,DuNDV、DPV和DuCV的核酸最低检出限分别为2.59×103、1.12×103、4.67×102拷贝/μL.对180份病料进行检测,结果DuCV阳性10份,阳性率为5.6％;DuNDV阳性1份,阳性率为0.56％.结果表明,建立的多重PCR方法可以应用于DuNDV、DPV和DuCV的临床检测和流行病学调查.     

番鸭细小病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测番鸭细小病毒(MDPV)的方法,本研究根据GenBank中MDPV的REP基因序列,设计一对特异性引物和一条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测MDPV的荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法检测敏感性达到20 copies,比常规PCR灵敏度高100倍;而且该方法对鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副粘病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等的检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法的批内和批间的检测变异系数均小于2%。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,其MDPV阳性率为11.02%。结果提示广西地区的鸭群中MDPV的感染比较普遍,建立的荧光定量PCR方法可以用于MDPV的临床快速检测。     

1株白鹭源新城疫病毒致病特性及全基因组序列测定分析

2011年从广西防城港市1只患病白鹭中分离到1株新城疫病毒(命名为WBE-10),为了对其主要生物学特性及基因组序列进行研究,对该毒株进行了1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)的测定和全基因组扩增(RT-PCR)。结果显示:该病毒的ICPI值为1.846,表明该毒株属于强毒株,F基因的112～117位氨基酸序列为112R-R-R-K-R-F117,符合NDV强毒株的特征,该结果与ICPI的测定结果一致;F基因绘制的遗传进化树表明该毒株属于基因VIIa型,与Sukorejo/019/10株的亲缘关系最近,该分离株在全基因组序列与印度尼西亚鸡分离株Sukorejo/019/10较接近。本试验为进一步了解候鸟源携带新城疫病毒与家禽新城疫疫病传播、暴发之间的联系提供一定的科学依据。     

鸡毒支原体强弱毒株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG强毒株和弱毒株的基因组序列,选取特异性保守区序列设计了2对引物和2奈探针,分别用于强弱毒株和弱毒株的检测,优化反应条件,建立了能区分MG强、弱毒株的荧光定量PCR检测方法.该法特异性强,对鸡常见呼吸道病原体的反应均为阴性;灵敏度高,可检测到100拷贝/μL的模板;稳定性好,批内和批间试验Ct值的变异系数小.本研究建立的MG强、弱毒鉴别检测方法简便、快捷,为该病的防控与净化提供新方法、新思路.