鸡肝细胞中C/EBPα基因的敲低及对糖脂代谢相关基因表达的影响

C/EBPα即CCAAT/增强子结合蛋白α基因,其编码的CCAAT/增强子结合蛋白是重要的转录调控因子,在细胞的分化和代谢过程中发挥着重要的调节作用。试验利用RNAi来敲低鸡LMH细胞系中C/EBPα基因的表达,以研究C/EBPα基因影响脂肪代谢的机制。根据鸡C/EBPα基因的mRNA序列,设计3对siRNA,用RNAi干扰技术来敲低鸡LMH细胞中的C/EBPα基因表达,然后用荧光定量PCR检测C/EBPα基因的表达情况,发现其中的C/EBPα-siRNA-161能够显著降低C/EBPα基因的表达;并将C/EBPα-siRNA-161转染LHM细胞后48 h后,利用荧光定量PCR检测LMH细胞中糖脂代谢相关基因(PCK1、SCD、GLUT2、PPARγ、INS、G6PC、IGF1、IGF2、INSR、STAT3)的表达,发现在LMH细胞中PCK1、G6PC、GLUT2基因的mRNA表达量下降,结果表明C/EBPα基因能影响糖代谢相关基因G6PC、GLUT2、甘油异生相关基因PCK1的表达,证实了C/EBPα基因对鸡肝细胞中的糖脂代谢具有调控作用,通过调控C/EBPα基因的表达将影响糖吸收及甘油异生。     

全悬浮培养LMH细胞制备FAdV-4灭活疫苗的研究

通过对LMH细胞进行驯化,获得一株可全悬浮培养的LMH细胞,命名为LMH-S。此细胞可适应无血清、高密度悬浮培养,以初始细胞密度0.5×10⁶/mL～1×10⁶/mL接种,细胞密度最高达6×10⁶/mL。研究确定生物反应器悬浮培养LMH-S细胞制备FAdV-4抗原的最优参数为：接毒时细胞密度2×10⁶/mL～3×10⁶/mL、接毒量0.1MOI～1MOI、接毒后48 h～72 h收毒,所获抗原病毒含量不低于10^9.25TCID₅₀/mL。试验鸡分别免疫0.02 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.3 mL疫苗,攻毒保护率分别为9/10、10/10、10/10、10/10,表明疫苗有效性良好。本试验成功建立了LMH全悬浮培养细胞株,确定了FAdV-4抗原的生物反应器悬浮培养工艺,验证了悬浮培养抗原的免疫原性,为高效FAdV-4灭活疫苗的研制奠定了基础。     

禽白血病病毒衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体的构建及其在鸡肝癌细胞系中的表达

构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1上,构建成plvx-p15-Flag慢病毒表达质粒,将该质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,将细胞上清中的病毒感染LMH细胞,检测p15蛋白表达情况。慢病毒载体在293T细胞上包装完成后,病毒滴度为2.25×10⁵ TU/mL。慢病毒感染LMH细胞,基因和蛋白水平检测结果表明,p15蛋白表达良好。表达ALV p15基因的慢病毒包装成功,并且能够感染鸡源LMH细胞。该载体的构建为进一步研究p15蛋白的生物学功能提供工具。