泛酰巯基乙胺酶(Vanin-1)基因的研究进展

Vanin-1(VNN1)是泛酰巯基乙胺酶家族的一个成员,它是一类泛酰巯基乙胺的水解酶,能催化辅酶A(Co A)和酰基载体蛋白的异化途径中D-泛酰巯基乙胺的水解。Vanin有3种同源基因,分别是Vanin-1、Vanin-2和Vanin-3,其中Vanin-1是3种同源基因中研究最多的一种,它除了对底物的催化作用外,在糖脂代谢、免疫、肿瘤形成等生命过程中发挥十分重要的作用。本文就该基因的研究进展进行综述。     

鸡肝细胞中C/EBPα基因的敲低及对糖脂代谢相关基因表达的影响

C/EBPα即CCAAT/增强子结合蛋白α基因,其编码的CCAAT/增强子结合蛋白是重要的转录调控因子,在细胞的分化和代谢过程中发挥着重要的调节作用。试验利用RNAi来敲低鸡LMH细胞系中C/EBPα基因的表达,以研究C/EBPα基因影响脂肪代谢的机制。根据鸡C/EBPα基因的mRNA序列,设计3对siRNA,用RNAi干扰技术来敲低鸡LMH细胞中的C/EBPα基因表达,然后用荧光定量PCR检测C/EBPα基因的表达情况,发现其中的C/EBPα-siRNA-161能够显著降低C/EBPα基因的表达;并将C/EBPα-siRNA-161转染LHM细胞后48 h后,利用荧光定量PCR检测LMH细胞中糖脂代谢相关基因(PCK1、SCD、GLUT2、PPARγ、INS、G6PC、IGF1、IGF2、INSR、STAT3)的表达,发现在LMH细胞中PCK1、G6PC、GLUT2基因的mRNA表达量下降,结果表明C/EBPα基因能影响糖代谢相关基因G6PC、GLUT2、甘油异生相关基因PCK1的表达,证实了C/EBPα基因对鸡肝细胞中的糖脂代谢具有调控作用,通过调控C/EBPα基因的表达将影响糖吸收及甘油异生。     

Sirt1基因稳定低表达的LMH细胞系构建

为构建Sirt1基因低表达的LMH细胞系,根据鸡Sirt1基因的3′UTR序列设计gSmiR30、gSmiR70和gSmiR91 3个miRNAs,以质粒pLNCX-gSmiRn(n为30、70或91)分别过表达这3个miRNAs 48 h后,依次检测其对CHO-K1细胞中报告载体psiCHECH2-gSirt1-UTR672所表达的荧光素酶活性的影响以及对LMH细胞中Sirt1基因表达的干扰情况;然后选用干扰效果较好的pLNCX-gSmiR30包装的反转录病毒感染LMH细胞,以终浓度1μg·mL~(-1)的G418筛选稳定过表达gSmiR30的LMH-gSmiR30细胞系,荧光定量PCR和Western blot检测Sirt1基因的表达。结果表明:人工设计的3个miRNAs可抑制含靶位点的海肾荧光素酶活性在97%以上;且LMH细胞中Sirt1的mRNA表达水平均能被这3个miRNAs下调40%以上;筛选得到的LMH-gSmiR30细胞中绿色荧光蛋白的表达率在99%以上,细胞内Sirt1基因的mRNA水平下降75%, SIRT1蛋白也明显减少。这一研究成功获得了Sirt1基因低表达的LMH-gSmiR30细胞系,为进一步研究Sirt1基因在鸡肝脏中的功能提供了一种很好的细胞模型。     

赛尔矿区松散泥岩巷道支护技术研究

针对赛尔三矿巷道围岩松散、水化风化影响严重的问题,分析了巷道原支护方案存在的问题及影响巷道围岩稳定的主要因素,运用理论分析和数值模拟等手段优化了巷道支护参数,设计了不同围岩条件下的巷道支护方案。现场监测表明,采用优化的支护方案后,巷道表面位移大幅下降,巷道围岩稳定性有了明显提高,巷道支护效果良好。     

鸡营养应激中SIRT1基因对肝脏脂类代谢的影响

本研究旨在探讨SIRT1基因在鸡肝脏脂类代谢中的功能。采用荧光定量PCR和免疫印迹检测34日龄广西三黄鸡在禁食24 h之后肝内SIRT1及其他糖脂代谢相关基因的表达水平,并测定血糖、血脂变化;检测SIRT1低表达的LMH-gSmiR30细胞系在葡萄糖和棕榈酸处理后细胞内糖脂代谢相关基因的表达水平及胞内脂滴的形成。结果表明:禁食24 h后,血液中甘油三酯浓度显著降低,肝内SIRT1基因的mRNA和蛋白水平显著增加,PGC-Lα、PPARα和ATGL基因表达也显著增加,但FASN基因表达则显著下降;禁食24 h后恢复2h采食,血糖和血液中甘油三酯浓度迅速回升,而肝内SIRT1、PGC-Lα、PPARα和ATGL基因的mRNA水平迅速降至正常喂饲组水平,FASN基因的mRNA水平则回升至对照组的25%;ATGL在SIRT1基因低表达的LMH-gSmiR30细胞中的mRNA表达水平略低于对照组细胞LMH-pmirG中的表达,而高浓度的葡萄糖和棕榈酸对LMH-gSmiR30细胞中ATGL的mRNA表达抑制更为明显,而且细胞内脂滴显著增多。以上结果说明,鸡肝脏中SIRT1基因的表达受营养状态的调控,同时SIRT1基因影响着肝细胞内脂类代谢过程。     

鸡HNF1α在大肠杆菌中的表达及其纯化

肝细胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α)调控众多的肝脏特异性基因,参与机体的脂类、糖类和蛋白质的代谢过程。以PCR技术从本研究室已构建的真核表达载体pc DNA3.1-HNF1α质粒上扩增获得鸡(Gallus gallus)HNF1α的编码序列,在其5′、3′端分别引入的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,以此位点将其克隆入p ET30a表达载体,并构建获得重组表达菌BL21-p ET30a-HNF1α。然后以不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)(0.1~0.8 mmol/L)优化重组蛋白的诱导表达,并采用15℃的低温诱导重组蛋白的可溶性表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot分析结果显示,与未诱导组相比,重组表达菌在37℃下,经不同浓度的IPTG诱导4 h后均能产生一条约69 k D的蛋白条带,与预计目的蛋白HNF1α的大小相一致,且IPTG浓度在0.1 mmol/L时诱导重组蛋白的量高于其他浓度组,而低温诱导未能使重组蛋白可溶性表达。于是采用8 mol/L尿素变性包涵体,溶解重组蛋白,通过融合在HNF1α重组蛋白C端的6-His多肽,以Ni2+对重组蛋白进行亲和层析纯化,结合固—液两相法对目的蛋白进行原位复性。结果显示通过Ni2+亲和层析和目的蛋白原位复性相结合的一步纯化法,成功地从包涵体中获得了纯度高达95%以上的重组蛋白HNF1α,这为研究鸡HNF1α在糖脂代谢、机体生长及抗体的制备等方面提供了物质保障。