紫花苜蓿MsLEA4启动子的克隆及表达分析

为了深入研究紫花苜蓿（Medicago sativa）MsLEA4基因的功能,本试验采用染色体步移技术从紫花苜蓿基因组中扩增出MsLEA4启动子序列,构建GUS植物超表达载体,并根据序列分析结果对紫花苜蓿进行相应逆境胁迫。结果表明：紫花苜蓿MsLEA4启动子含有响应脱落酸（abscisic acid,ABA）调控的顺式作用元件ABRE,响应赤霉素（gibberellin,GA）调控的顺式作用元件P-box,参与胚乳合成的顺式作用元件GCN4和Skn-1,以及涉及光调控和光周期的顺式作用元件;外源ABA、GA、持续光照以及黑暗均能诱导MsLEA4基因的表达;GUS基因只在拟南芥花和荚果中表达。因此,MsLEA4基因能参与紫花苜蓿的逆境调控,与该基因启动子序列中所含的一系列顺式作用元件相关。本研究为进一步探索MsLEA4基因在紫花苜蓿逆境胁迫、光调控以及组织特异性表达中的作用奠定了基础。     

过表达长穗偃麦草EeHKT1；4基因增强拟南芥抗旱耐盐性分析

植物高亲和性K⁺转运蛋白基因（HKT）编码K⁺、Na⁺转运或K⁺-Na⁺共转运质膜通道蛋白,在植物抗逆过程中发挥重要作用。为了研究长穗偃麦草EeHKT1;4（GenBank： KF956112.1）的功能作用,构建了EeHKT1;4过表达植物表达载体转化拟南芥,进行拟南芥转基因植株的抗旱耐盐性评价分析。结果显示,正常生长条件下野生型（WT）与转基因株系的主根长度无差异,NaCl与甘露醇处理下WT和转基因株系根的生长受到抑制,转基因株系根长度均大于同等胁迫条件下（WT）的根长;正常生长条件下WT与转基因株系表型无显著差异,但在NaCl与甘露醇处理下WT表现出叶片萎缩和植株枯黄,转基因株系仅部分植株表现出叶片萎缩,同一胁迫条件下转基因株系的植株存活率皆高于WT。硝基氮蓝四唑（NBT）与二氨基联苯胺（DAB）染色结果显示,正常生长条件下WT与转基因株系叶片染色相对较浅,随着NaCl与甘露醇浓度提高,所有叶片染色程度逐渐加深且同等胁迫下WT染色程度高于转基因株系。以正常生长条件下基因的表达量为对照,随着NaCl浓度的增加,AtSOS1基因在WT和转基因植株中逐渐上调且在转基因中的表达量高于WT;AtNHX1基因在NaCl处理下上调表达且转基因植株中表达量低于WT,除转基因株系L5外并未检测到WT和转基因株系自身因NaCl浓度的提高AtNHX1基因表达量发生改变;在甘露醇处理下,AtRD29B和AtP5CS1基因均上调表达且转基因植株中表达量高于WT。综上所述,EeHKT1;4过表达降低了逆境胁迫下拟南芥中超氧阴离子和H₂O₂的积累,诱导抗逆基因上调表达,增强拟南芥抗旱耐盐性。     

超表达桑树MaNHX1和拟南芥AVP1基因增强拟南芥耐盐性的研究

盐胁迫会严重影响作物的生长发育,培育和种植耐盐胁迫的作物品种有利于对盐渍化土地的开发利用。Na+/H+逆向转运蛋白基因(NHX)已被证实与作物的耐盐性有关。将克隆的桑树Ma NHX1基因和拟南芥焦磷酸酶基因AVP1分别转入拟南芥植株,筛选获得转基因株系MN和AV,并通过人工授粉杂交后筛选获得共表达2个基因的转基因拟南芥株系MNV,用于探究Ma NHX1和AVP1共表达增强植株耐盐性的机制,确证Ma NHX1基因在盐胁迫适应性调节中的功能。在200 mmol/L Na Cl胁迫条件下,共表达转基因拟南芥株系MNV与野生型植株相比,叶片中的叶绿素含量高出20.69%,含水率高出5.89%,脯氨酸含量高出28.42%,而丙二醛含量的增幅下降7.73%。研究结果表明:超表达耐盐性基因的转基因株系可以通过维持细胞膜稳定性、降低膜损伤和透性伤害等机制应对盐胁迫环境。     

干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞乳脂和酪蛋白的影响

通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ（si-HSD17B4）基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 mRNA在水牛各个组织中的相对表达量。合成3条水牛HSD17B4小干扰RNA （siRNA）和1条对照si-HSD17B4-nc （si-nc）,并筛选干扰效果最佳的片段和时间。si-HSD17B4转染水牛乳腺上皮细胞后,通过酪蛋白试剂盒检测酪蛋白的表达情况,通过甘油三酯测定和油红O染色检测甘油三酯含量,通过实时荧光定量PCR检测干扰HSD17B4基因对甘油三酯、脂肪酸合成以及氧化相关基因表达的影响。结果表明,HSD17B4基因在水牛心脏和卵巢中相对高表达,且显著高于其他组织（P<0.05）。3条HSD17B4 siRNA片段均能有效地抑制HSD17B4基因的表达,其中si-HSD17B4-1干扰效果最佳,HSD17B4 mRNA表达量极显著低于对照组（P<0.01）;最佳干扰时间为24 h。酪蛋白检测结果显示,干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成无影响。甘油三酯测定结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中甘油三酯含量上升,差异显著（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中的脂滴明显增多。实时荧光定量PCR检测结果显示,干扰HSD17B4基因会使FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2、PLIN2、BTN1A1基因表达量上调,分别上调9.28（P<0.01）、1.36（P<0.05）、1.17（P<0.05）、1.83（P<0.01）、1.60（P<0.01）和2.17（P<0.01）倍;同时使PPARA、SREBP1C、SCD、ACSS2、ACACA、AGPAT6、LPIN1、XDH、ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因表达量下降,分别下调至50.55%（P>0.05）、61.15%（P<0.01）、84.91%（P<0.01）、89.34%（P<0.01）、21.88%（P<0.01）、86.48%（P<0.01）、25.35%（P<0.01）、27.24%（P<0.01）、41.74%（P<0.01）、22.17%（P<0.01）、62.70%（P<0.01）和70.33%（P<0.01）。结果表明,HSD17B4基因在水牛组织中广泛表达;si-HSD17B4高效抑制HSD17B4基因在水牛乳腺上皮细胞中的表达,未检测到干扰HSD17B4基因对乳腺上皮细胞酪蛋白的影响,干扰HSD17B4基因上调了FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2基因的表达,从而促进甘油三酯的合成,同时降低ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因的表达,减少脂肪酸β-氧化。     

转基因冰草植株耐盐性研究

以转P5CSF129A基因的冰草属(Agropyron Gaertn)阳性植株(97#、19#、66#)和阴性植株为材料,测定叶片脯氨酸含量、相对含水量、质膜透性和K⁺/Na⁺比值4项耐盐指标。结果表明:转基因植株的脯氨酸含量明显高于阴性植株,说明P5CSF129A基因已经在冰草转化植株体内表达,提高了转基因植株的耐盐性;其它耐盐指标的结果也证明转基因冰草植株的耐盐性高于对照植株。对转基因植株和阴性植株的耐盐能力综合评定结果是97#>19#>66#>阴性植株。     

紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及耐盐功能鉴定

为验证紫花苜蓿(Medicago sativa L.)胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase，CCD)基因的耐盐功能，本试验克隆了紫花苜蓿MsCCD4的CDS全长序列，并以其叶片为试验材料，通过发根农杆菌介导的毛状根诱导法获得过表达MsCCD4的转基因毛状根，验证过表达MsCCD4对紫花苜蓿耐盐性的影响。结果表明：MsCCD4为稳定的酸性亲水蛋白质，二级结构以无规则卷曲为主，C-端含有RPE65保守结构域；MsCCD4启动子区含有光响应、激素应答和非生物胁迫响应结合元件；盐胁迫可诱导MsCCD4表达量升高；盐胁迫生理实验证明，过表达MsCCD4可以增强毛状根的耐盐性。本研究为紫花苜蓿耐盐遗传改良提供基因资源及耐盐基因快速鉴定方法。     

GsCRCK基因转化农菁1号苜蓿及其耐盐性分析

GsCRCK基因是参与胁迫早期应答的钙/钙调素调控的受体类蛋白激酶基因,研究发现GsCRCK正向调控拟南芥对NaCl和ABA胁迫的耐性,将耐盐蛋白激酶基因GsCRCK转化苜蓿,对于增强苜蓿的耐盐性具有重要的现实意义。本研究采用农杆菌介导法将其转入农菁1号苜蓿,获得大量抗性植株。经 PCR和RT-PCR检测证明GsCRCK基因已整合到农菁1号苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。对获得的2个转基因株系进行耐盐性分析,在300 mmol/L NaCl条件下进行胁迫处理,测定处理0,3,6,9,12,15 d后的质膜透性、丙二醛(MDA)和叶绿素(Chl)含量,以及胁迫15 d时的SOD活性;并统计400 mmol/L NaCl处理15 d时各株系的死亡率。结果显示,300 mmol/L 高盐胁迫15 d后转基因苜蓿仍能正常生长,而野生型苜蓿则遭受盐害严重;转基因苜蓿的相对电导率极显著低于野生型,MDA含量也显著低于野生型,而Chl含量和SOD活性都显著高于野生型;在400 mmol/L NaCl处理下,2个转基因株系的死亡率分别为13.33%和10.00%,明显低于野生型植株(63.33%)。表明GsCRCK基因的导入提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

Gm4CL2基因对拟南芥和紫花苜蓿耐铝性的影响

4CL（4-coumarate： coenzyme A ligase）是木质素合成途径关键酶,已被证明在生物和非生物胁迫、机械损伤抗性等生物过程中具有重要作用,但与柠檬酸分泌相关的耐铝功能还没有报道。本研究选择丹波黑大豆Gm4CL2,利用RT-PCR技术克隆其全长编码序列,蛋白质序列多重序列比对和进化树分析不同物种间的亲缘关系,农杆菌介导浸花法和叶盘法分别遗传转化拟南芥和紫花苜蓿,qRT-PCR技术检测基因的表达水平。序列分析结果发现,Gm4CL2全长编码序列为1668 bp,该基因编码555个氨基酸,为双子叶植物Ⅰ类 4CL。Real-time PCR结果显示,50 μmol·L^-1 AlCl₃ （pH 4.5）特异诱导Gm4CL2在丹波黑大豆幼苗0~2 cm的根尖组织表达;过表达Gm4CL2拟南芥,在铝处理条件下其根尖AtMATE、AtSTAR1和AtSTAR2表达量显著上调（P<0.05）。Al³⁺胁迫条件下,过表达Gm4CL2拟南芥根相对伸长量、根尖SOD、POD活性和柠檬酸分泌量显著高于野生型,根尖伊文思蓝和铬天青S染色以及Al³⁺、ROS、MDA含量显著低于野生型（P<0.05）;过表达Gm4CL2紫花苜蓿根相对伸长率、根尖柠檬酸分泌量和生物量显著高于野生型,根尖Al³⁺含量、伊文思蓝染色显著低于野生型（P<0.05）。细胞壁成分分析表明,Al³⁺胁迫和非胁迫下,过表达Gm4CL2拟南芥根尖果胶、咖啡酸、阿魏酸比野生型显著降低（P<0.05）;Al³⁺胁迫下,过表达Gm4CL2拟南芥根尖木质素含量显著降低,但是4-香豆酸含量显著升高（P<0.05）。上述结果表明,Gm4CL2为耐铝基因,该基因通过促进细胞壁修饰和柠檬酸分泌提高拟南芥和紫花苜蓿的耐铝性。     

转BADH基因苜蓿T1代遗传稳定性和抗盐性研究

采用分子生物学检测和不同浓度的NaCl对转BADH基因苜蓿T1代2个株系进行遗传稳定性和抗盐性研究。结果表明,2个株系的T1代PCR阳性植株和阴性植株分离比例都符合孟德尔遗传规律;在0.8%NaCl胁迫下,转基因植株Northern杂交表达量明显增加,BADH酶活性和甜菜碱含量分别比对照植株增加2～4和4～5倍;不同浓度NaCl胁迫下转基因株系脯氨酸和可溶性糖含量、抗氧化酶活性都显著高于对照植株,而电导率和丙二醛含量显著低于对照植株。表明转入的BADH基因可以稳定遗传,转基因苜蓿植株耐盐性明显高于对照。     

西藏野生垂穗披碱草EnCBL10基因的克隆与功能研究

钙调磷酸酶B类蛋白（Calcineurin B-Like Proteins，CBLs）是钙信号通路中重要成员，在植物应答多种非生物胁迫中具有重要的作用。本研究基于前期转录组数据，在西藏野生垂穗披碱草（Elymus nutans Griseb.）中筛选EnCBL10基因，将其异源表达于烟草（Nicotiana tabacum）中，分析转基因植株EnCBL10在低温和干旱胁迫下的生长及生理响应。结果表明：EnCBL10开放阅读框为792 bp，编码263个氨基酸。EnCBL10蛋白的理论等电点为5.17，为疏水蛋白和非分泌蛋白。低温和干旱胁迫下，对比于野生型烟草，转基因烟草叶片的细胞膜稳定性显著增加，过氧化物酶（Peroxidase，POD），抗坏血酸过氧化物酶（Aseorbateperoxidase，APX）和谷胱甘肽还原酶（Gluathione reductase，GR）活性显著升高。低温胁迫下，两个转基因株系的脯氨酸含量分别提高了79.7%和70.8%（P<0.05）；在干旱胁迫下，野生型植株（WT）和过表达植株中脯氨酸含量均有所降低，但转基因植株比WT的下降幅度小。因此，EnCBL10基因可能在垂穗披碱草的耐寒和耐旱调控中发挥重要功能。     

盐水连续浇灌下107份黄花苜蓿苗期耐盐性评价

黄花苜蓿(Medicago falcata L.)具有较强的抗逆性,为探究盐水连续浇灌下黄花苜蓿苗期的耐盐能力及形态、生理的响应机制,本试验以达坂城盐湖水为母液,稀释至电导率为10mS·cm^-1、以自来水作为对照,采用连续浇灌法对盆栽条件下107份苗期的黄花苜蓿进行处理,测量株高、SPAD、丙二醛、Fo/Fm等指标,计算抗性指数,并利用关性分析、主成分分析、隶属函数分析、聚类分析及灰色关联度分析对供试材料耐盐性进行评价,筛选耐盐性相关指标。T检验结果表明,盐胁迫与可溶性糖相关性低,与SPAD显著相关(P＜0.05),与其余指标皆极显著相关(P＜0.01);通过主成分分析、隶属函数分析及聚类分析将107份材料以耐盐性程度划分为6各类群：极强、强、较强、较弱、弱和极弱,各类群占比为：9.35%,14.02%,25.23%,19.63%,26.17%和5.61%;耐盐性前3的材料是来自哈萨克的84号苜蓿、俄罗斯的48号苜蓿和新疆乌鲁木齐的97号苜蓿。通过灰色关联度分析,全叶面积、幅长和脯氨酸可作为黄花苜蓿苗期耐盐性评价的关键指标。     

辣蓼黄酮正丁醇部位对PRV感染3D4/2细胞氧化应激相关因子水平的影响

【目的】探究辣蓼黄酮正丁醇部位（N-butanol fraction of Polygonum hydropiper flavonoids,FNB）对猪伪狂犬病毒（Pseudoabies virus,PRV）体外感染猪肺泡巨噬细胞（3D4/2细胞）氧化应激相关因子的影响,旨在初步分析FNB的抗氧化效果。【方法】采用10^-1至10^-10浓度PRV体外感染猪肾细胞（PK15细胞）,计算病毒半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）;将3D4/2细胞分为BC组、DMSO组、PRV组、FNB 1、FNB2和FNB3组,BC组用DMEM培养液处理,其余各组用感染复数（multiplicity of infection,MOI）=0.1 RPV处理,孵育2 h后,PRV组添加DMEM培养液,DMSO组及FNB1、FNB2、FNB3组分别添加0.05% DMSO及12.5、25、50 μg/mL FNB的DMEM培养液。培养4、8、12、24 h后,分别收取各组细胞培养液上清和细胞,通过试剂盒测定细胞培养液上清中一氧化氮（NO）的含量、细胞内活性氧（ROS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、髓过氧化物酶（MPO）的活性和丙二醛（MDA）的含量。【结果】PRV的TCID₅₀为10^-8.25/0.1 mL;与BC组相比,PRV组上清中NO水平在4、8 h时极显著降低（P<0.01）,在12、24 h时极显著升高（P<0.01）,细胞内ROS在4 h时显著降低（P<0.05）,8~24 h时显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）,iNOS和XOD活性在8~24 h时显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）,MPO活性在4~24 h时显著升高（P<0.05）,MDA含量在4 h时显著降低（P<0.05）,12~24 h时显著升高（P<0.05）。与PRV组相比,FNB2组NO含量在4~8 h时显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）,在12 h时显著降低（P<0.05）,FNB3组在24 h时极显著升高（P<0.01）;细胞内ROS水平在4 h时极显著升高（P<0.01）,8~24 h时极显著降低（P<0.01）;FNB1组iNOS活性在4 h时显著升高（P<0.05）,3个FNB组iNOS活性在8~24 h时显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）,MPO和XOD活性在4~24 h时显著或极显著降低（P<0.05;P<0.01）,MDA含量在4 h时升高,8 h时FNB2、FNB3组MDA含量显著降低（P<0.05）,24 h时FNB1、FNB2组MDA含量显著降低（P<0.05）。【结论】FNB可以通过干预氧化应激相关因子的分泌调节细胞氧化应激水平,维持氧化与抗氧化的平衡,结果可为辣蓼黄酮正丁醇部位的开发应用提供理论依据。     

Glut4突变调控脂肪重分布及肌纤维重塑的机制研究

旨在探讨Glut4基因突变后骨骼肌能量代谢及肌纤维转化的分子机制。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建Glut4^Q177L突变鼠。选取22周龄健康的野生雄鼠和Glut4^Q177L突变雄鼠,即试验分为两组,每组3只,3个重复,进行表型评价和糖耐量、胰岛素耐量试验;荧光定量检测两组小鼠腓肠肌葡萄糖转运蛋白、脂代谢、肌纤维类型相关调控基因的表达差异;Western blot测定腓肠肌AMPK及其磷酸化蛋白含量。结果表明,突变鼠皮下脂肪和附睾脂重量显著低于对照组（P<0.05）;突变鼠糖耐量曲线下面积极显著增加（P<0.01）,表明其糖耐量受损;突变鼠血清中甘油三酯的含量显著下降（P<0.05）。相较于野生型小鼠,Glut4^Q177L突变鼠腓肠肌中Glut4、Glut1和Glut12等多个葡萄糖转运蛋白表达量显著升高（P<0.05）;葡萄糖摄取受限导致调控能量代谢关键基因AMPK在mRNA、蛋白和磷酸化修饰水平均显著升高（P<0.05）,同时促进与脂肪酸摄取与合成代谢相关的CD36和ATGL等基因表达上调（P<0.05）;慢速氧化型肌纤维（I型）和快速氧化型肌纤维（IIa型）相关基因表达极显著升高（P<0.01）,而快速酵解型纤维（IIb型）相关基因表达显著降低（P<0.05）。本研究结果显示,Glut4葡萄糖结合关键位点突变降低了骨骼肌和脂肪葡萄糖摄取能力,通过上调其它转运蛋白增加葡萄糖摄取;激活AMPK信号通路及分泌肌细胞因子调控脂肪分解以满足能量需求;促进线粒体丰富的氧化型肌纤维生成以提高能量利用效率。Glut4突变不仅可以为骨骼肌胰岛素抵抗提供有效的动物模型,还可以为家畜生物育种提供基因编辑参考位点。     

单宁酸和乳酸菌对紫花苜蓿青贮品质和体外瘤胃发酵的影响

为评价单宁酸和乳酸菌单独以及组合添加对紫花苜蓿（Medicago sativa L.）青贮品质和体外瘤胃发酵的影响,本试验以晾晒至含水量约为55%的初花期紫花苜蓿为青贮原料,设无添加剂为对照组（CK）,单宁酸（Tannic acid,TC）、乳酸菌（Lactic acid bacteria,L）和单宁酸+乳酸菌（Tannic acid+Lactic acid bacteria,TL）为添加剂处理组。青贮60 d后开袋取样,测定相关指标。结果表明：添加剂处理组均显著降低了青贮饲料的pH值、乙酸和非蛋白氮含量（P<0.05）,干物质和真蛋白含量显著增加（P<0.05）;添加剂处理组均能促进瘤胃丙酸生成,提高微生物蛋白产量（P<0.05）;与TC处理组相比,TL处理组能够减轻TC处理组对青贮饲料干物质降解的抑制作用。综上,单宁酸和乳酸菌组合添加对紫花苜蓿青贮饲料品质的调控作用效果最好。     

ALA对高温胁迫下苜蓿属3个品种叶片生理的影响

为探究5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)对苜蓿属(Medicago)植物耐热性的影响，以苜蓿属3个品种盆栽苗为材料、以常温无ALA (CK)和高温胁迫无ALA (Heat)为对照，研究不同浓度ALA (5，10，15，20，25 mg·L^-1)预处理对高温胁迫后叶片生理的影响。结果表明，42℃高温胁迫后，3个品种叶片的相对电导率和MDA含量显著升高(P<0.05)，其中WL525HQ、德钦苜蓿和楚雄南苜蓿相对电导率较CK分别升高205.844%，206.589%，226.741%，MDA含量则升高112.649%，110.140%，124.664%，且叶片严重失绿。但喷施不同浓度ALA后可有效减少MDA含量和相对电导率(P<0.05)，缓解叶片失绿，同时提高叶绿素a、b和总叶绿素含量(P<0.05)，并且叶片中SOD、POD和CAT活性较高(P<0.05)。通过双因素方差分析表明，在影响苜蓿各耐热性指标的因素中，处理和品种虽有显著影响，但其作用大小为处理>品种。以8个生理指标进行隶属函数分析表明，20 mg·L^-1ALA预处理对3个品种缓解高温胁迫的效果最好。