PLIN2调控宁乡猪原代肾成纤维细胞ω-3 PUFA组成的研究

为研究PLIN2基因对中国本土猪宁乡猪长链omega-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFA）的调控作用，利用CRISPR/Cas9技术敲除宁乡猪原代肾成纤维细胞PLIN2基因，获得PLIN2纯合敲除细胞系，检测其脂肪酸含量及组成变化。结果显示：与野生型细胞相比，PLIN2-/-细胞的多不饱和脂肪酸总含量增加55.92%，ω-3 PUFA含量增加112.02%，多不饱和脂肪酸含量在总脂肪酸中的占比由27.78%增加至34.40%。因此，PLIN2基因对宁乡猪原代肾成纤维细胞多不饱和脂肪酸和ω-3PUFA的形成具有正向调控作用。本研究为揭示PLIN2调控脂肪酸的分子机理提供了重要参考，并为猪肉品质改良的生物育种提供了候选靶点。     

FADS2基因在奶牛乳腺细胞中的过表达和干扰研究

为了研究脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturases 2,FADS2)基因在奶牛乳腺细胞脂肪酸代谢中的作用,本研究在奶牛乳腺上皮细胞中对FADS2基因进行过表达和干扰,研究FADS2基因表达对脂肪酸合成相关基因的调控及对奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量的影响。针对FADS2基因的CDS序列设计siRNA和过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP,转染奶牛乳腺细胞检测FADS2基因过表达和干扰对脂肪酸代谢相关基因表达的影响及细胞中甘油三酯含量的变化。结果显示,试验成功获得过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP和干扰片段,转染细胞后具有良好的过表达和干扰效果。FADS2基因过表达后,1-酰基甘油磷酸酰基转移酶(AGPAT1)、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、3-磷酸甘油转移酶(GPAM)、脂肪酸延长链5(ELOVL5)、乙酰辅酶A酰基转移酶1(ACAA1)、脂肪酸脱氢酶1(FADS1)、二酰基甘油转酰基酶1(DGAT1)和过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)基因显著下调(P<0.05),脂滴蛋白2(PLIN2)基因极显著上调(P<0.01)。FADS2基因干扰过后可引起AGPAT1、GPAM、ELOVL5、ACAA1、PLIN2和FADS1基因显著上调(P<0.05),脂肪酸合成胰岛素诱导基因1(INSIG1)极显著上调(P<0.01),DGAT1和PPARα基因显著下调(P<0.05)。甘油三酯检测结果显示,FADS2基因过表达和干扰均可降低奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,FADS2基因能调控脂质合成相关基因的表达,对乳腺脂质合成具有调控作用。     

FADS2基因在奶牛乳腺细胞中的过表达和干扰研究

为了研究脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturases 2,FADS2)基因在奶牛乳腺细胞脂肪酸代谢中的作用,本研究在奶牛乳腺上皮细胞中对FADS2基因进行过表达和干扰,研究FADS2基因表达对脂肪酸合成相关基因的调控及对奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量的影响。针对FADS2基因的CDS序列设计siRNA和过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP,转染奶牛乳腺细胞检测FADS2基因过表达和干扰对脂肪酸代谢相关基因表达的影响及细胞中甘油三酯含量的变化。结果显示,试验成功获得过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP和干扰片段,转染细胞后具有良好的过表达和干扰效果。FADS2基因过表达后,1-酰基甘油磷酸酰基转移酶(AGPAT1)、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、3-磷酸甘油转移酶(GPAM)、脂肪酸延长链5(ELOVL5)、乙酰辅酶A酰基转移酶1(ACAA1)、脂肪酸脱氢酶1(FADS1)、二酰基甘油转酰基酶1(DGAT1)和过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)基因显著下调(P0.05),脂滴蛋白2(PLIN2)基因极显著上调(P0.01)。FADS2基因干扰过后可引起AGPAT1、GPAM、ELOVL5、ACAA1、PLIN2和FADS1基因显著上调(P0.05),脂肪酸合成胰岛素诱导基因1(INSIG1)极显著上调(P0.01),DGAT1和PPARα基因显著下调(P0.05)。甘油三酯检测结果显示,FADS2基因过表达和干扰均可降低奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,FADS2基因能调控脂质合成相关基因的表达,对乳腺脂质合成具有调控作用。     

乙型脑炎病毒NS1和NS1-2A蛋白的真核表达及其差异性研究

为深入研究乙型脑炎病毒（JEV）NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1（+）上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1（+）免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1（+）空载体免疫组差异极显著（P<0.01）;pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。     

藏绵羊KLF7基因表达特征分析及其过表达对前脂肪细胞增殖分化的影响

【目的】分析藏绵羊Krüppel样因子7(Krüppel-like factor 7,KLF7)基因表达特征,研究过表达该基因对前脂肪细胞增殖及分化的影响。【方法】从藏绵羊脂肪组织中分离前脂肪细胞进行培养及成脂诱导,应用实时荧光定量PCR技术检测KLF7基因在藏绵羊7个组织(大脑、皮下脂肪、肾脏、背最长肌、瘤胃、睾丸和回肠)和前脂肪细胞不同分化阶段(第0、2、4和8天)的mRNA相对表达水平;应用RT-PCR方法从藏绵羊脂肪组织中扩增KLF7基因CDS区序列,并将其连接到pcDNA3.1(+)真核表达载体获得pcDNA3.1-KLF7过表达质粒,转染前脂肪细胞;应用实时荧光定量PCR方法检测脂肪细胞增殖及分化标志基因mRNA表达水平;采用EdU和CCK-8方法分别检测过表达KLF7基因对EdU阳性细胞数和细胞活力的影响;采用油红O染色检测过表达KLF7基因后脂肪细胞脂滴生成量。【结果】KLF7基因在藏绵羊7个组织中均有表达,其中在大脑中的表达量最高,其次为皮下脂肪和肾脏,均显著高于其他组织(P<0.05);诱导分化第2、4和8天脂肪细胞mRNA表达量均显著高于分化前(P＜0.05),且分化第2天表达量最高;pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞2 d后显著或极显著抑制增殖标志基因CDK4、CyclinB1和CyclinD1的表达水平(P＜0.05;P＜0.01),极显著降低细胞活力及EdU阳性细胞数量(P＜0.01);pcDNA3.1-KLF7过表达质粒转染前脂肪细胞,诱导分化8 d后,脂肪细胞分化标志基因PPARγ、Glut4和ELOVL6的mRNA相对表达水平显著或极显著下调(P＜0.05;P＜0.01),且脂质沉积极显著减少(P＜0.01),表明过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞增殖及分化。【结论】KLF7基因在藏绵羊多个组织中广泛表达,且大脑、皮下脂肪、肾脏中表达量较高;诱导分化后脂肪细胞表达量显著高于分化前,且分化第2天表达量最高;过表达KLF7基因可抑制藏绵羊前脂肪细胞的增殖及分化。试验结果为阐明藏绵羊脂肪沉积的分子调控机制提供了基础数据。     

山羊DGAT1基因的克隆及对前体脂肪细胞脂质沉积的调控作用研究

旨在克隆山羊DGAT1基因序列,明确DGAT1基因在山羊不同组织中的表达模式,并进一步揭示过表达DGAT1基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响。本试验以10月龄健康简州大耳公羊（n=7）为试验动物。采用RT-PCR法克隆山羊DGAT1基因序列,并对序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测DGAT1在山羊不同组织中的相对表达水平;采用双酶切法构建pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测DGAT1过表达效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过油红O染色法观察过表达DGAT1对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量。结果显示,获得山羊DGAT1基因序列全长1 651 bp （GenBank登录号：MT221183）,包含5'UTR 125 bp,CDS 1 470 bp,3'UTR 56 bp,编码489个氨基酸残基;山羊DGAT1基因在小肠中的表达量最高,在脾中表达量最低;RT-qPCR检测结果显示,DGAT1在细胞中过表达极显著（P<0.01）,GPAM基因的相对表达水平显著上调（P<0.05）,ADRP和ACOX1基因极显著上调（P<0.01）,而AGPAT6基因相对表达水平显著下调（P<0.05）,MLYCD和HSL基因极显著下调（P<0.01）;油红O染色结果显示,过表达DGAT1后脂滴聚积相较于对照组极显著增多（P<0.01）,甘油三酯测定结果显示,过表达DGAT1基因可极显著增加山羊肌内脂肪细胞甘油三酯含量（P<0.01）。本研究成功获得山羊DGAT1基因CDS区序列并构建了pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体,过表达DGAT1可显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,并显著影响脂质代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明DGAT1对调控山羊肌内脂肪代谢的作用机制提供了重要数据。     

WIP1基因对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响及其在小鼠不同生长阶段的表达

【目的】探究野生型p53诱导磷酸酶1(WIP1)基因与脂肪细胞增殖和分化的关系,以期为猪优质性状育种提供新基因素材。【方法】利用脂质体转染方法将合成的WIP1基因的3对siRNAs (WIP1-790、WIP1-893和WIP1-1845)和阴性对照NC-siRNA分别转染3T3-L1前脂肪细胞,通过实时荧光定量PCR检测WIP1基因的表达水平,比较不同siRNA的干扰效率。然后利用筛选到的干扰效率最高的siRNA敲减WIP1基因在3T3-L1前脂肪细胞中的表达,通过CCK-8检测siRNA敲减细胞和NC-siRNA细胞不同生长时期(0、12、24、48、72、96和120 h)的增殖情况,并通过实时荧光定量PCR检测上述2种细胞24和48 h的细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)和Cyclin D1的表达水平。对干扰效率最高的siRNA和NC-siRNA组3T3-L1前脂肪细胞进行成脂诱导分化,通过油红O染色和甘油三酯定量法评估成脂分化效率,利用实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)的表达水平,Western blotting法检测PPARγ蛋白的表达水平;通过实时荧光定量PCR检测WIP1基因在21日龄、8周龄和6月龄小鼠腹股沟皮下脂肪组织和性腺脂肪组织的时空表达情况。【结果】基因干扰试验结果显示,3对siRNAs对WIP1基因的表达均具有极显著的干扰作用(P＜0.01),其中WIP1-790的干扰效率最高,达到了70%以上。CCK-8检测结果显示,与NC-siRNA组相比,WIP1-790干扰组细胞的增殖速率在各生长时期均极显著降低(P＜0.01),且细胞周期基因Cyclin B1和Cyclin D1的表达量在24和48 h均极显著下调(P＜0.01)。成脂诱导分化结果显示,与NC-siRNA组相比,WIP1-790干扰组细胞在成脂分化第8天油红O染色阳性细胞明显减少,脂滴含量极显著降低(P＜0.01),甘油三酯含量显著降低(P＜0.05);PPARγ、C/EBPα、FABP4、SCD1等标记基因mRNA表达水平均极显著降低(P＜0.01),PPARγ蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01)。WIP1基因在8周龄和6月龄小鼠的腹股沟皮下脂肪组织中的表达量分别显著或极显著高于21日龄小鼠(P＜0.05;P＜0.01),且在6月龄小鼠的性腺脂肪组织中,WIP1基因的表达量极显著高于21日龄和8周龄的小鼠(P＜0.01)。【结论】WIP1基因通过调控Cyclin B1、Cyclin D1和PPARγ等细胞周期和成脂分化相关基因的表达影响3T3-L1细胞的增殖和分化,且参与小鼠脂肪沉积过程,结果可为深入解析WIP1基因调控脂肪发生的分子机制提供参考。     

山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体的构建和生物信息学分析

试验旨在构建山羊昼夜运动输出周期蛋白(circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)基因真核表达载体,系统分析山羊CLOCK蛋白的生物学特性。从山羊卵巢组织中提取总RNA,反转录成cDNA后经PCR扩增山羊CLOCK基因CDS区序列,并以同源重组的方式将其连接至pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体;经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gCLOCK;将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gCLOCK质粒分别转染至HEK293T细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测山羊CLOCK基因的表达效果,并对山羊CLOCK基因进行系统的生物信息学分析。结果显示,山羊CLOCK基因CDS区片段长2 538 bp,将其与线性化的pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体重组连接并通过酶切和测序鉴定后,成功构建了pcDNA3.1-3HA-gCLOCK真核表达载体;实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,pcDNA3.1-3HA-gCLOCK转染组CLOCK基因在mRNA和蛋白水平的表达量均极显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA对照组(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,山羊CLOCK基因CDS区序列与绵羊、牛和马的相似性分别为99.4%、98.7%和95.6%。山羊CLOCK蛋白是一种不稳定蛋白,具有一定的亲水性,无跨膜区和信号肽。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成;三级结构与小鼠和人的CLOCK蛋白相比具有极高的相似性。本研究成功构建了山羊生物钟基因CLOCK真核表达载体,并进行了生物信息学分析,为进一步研究山羊CLOCK基因的生物学功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了材料。     

地锦草水提物在IPEC-J2细胞中的抗炎与抗氧化作用

【目的】为了揭示地锦草(EH)在猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中的抗炎和抗氧化作用。【方法】利用不同浓度EH水提物(0、5、10、50、125、200 μg/mL)处理IPEC-J2 细胞12 h,通过CCK-8法检测IPEC-J2细胞活力,确定EH处理细胞的最佳浓度。将IPEC-J2细胞随机分为对照组(CT)、脂多糖(LPS)组(LPS)、EH+LPS组(ELP),每组3个重复。CT组细胞正常培养不做任何处理,LPS组细胞用5 μg/mL LPS处理,ELP组细胞用5 μg/mL LPS和最佳浓度EH共处理,各组细胞均处理12 h后,收集细胞和上清。利用实时荧光定量PCR方法检测细胞中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)mRNA表达;ELISA法检测上清液中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量,化学荧光法检测上清液中活性氧(ROS)水平。【结果】与0 μg/mL EH组相比,5、50 μg/mL EH组IPEC-J2细胞活力显著增加(P＜0.05);10 μg/mL EH组IPEC-J2细胞活力极显著增加(P＜0.01),125 μg/mL EH组IPEC-J2细胞活力下降,但差异不显著(P＞0.05),200 μg/mL EH组IPEC-J2细胞活力极显著下降(P＜0.01)。因此,后续选用10 μg/mL EH处理IPEC-J2细胞。与CT组相比,LPS组IPEC-J2细胞中IL-6、TNF-α基因mRNA的表达极显著增加(P＜0.01),上清液中MDA含量和细胞ROS的荧光强度极显著增加(P＜0.01),Keap1、Nrf2和HO-1基因mRNA表达极显著下降(P＜0.01),抗氧化酶SOD、GSH-Px的含量极显著下降(P＜0.01)。与LPS组相比,ELP组IPEC-J2细胞中IL-6基因mRNA表达极显著下降(P＜0.01),TNF-α基因mRNA的表达显著下降(P＜0.05),细胞上清液中MDA含量和细胞ROS的荧光强度均极显著下降(P＜0.01),Keap1、Nrf2、HO-1基因mRNA表达极显著增加(P＜0.01),GSH-Px含量极显著升高(P＜0.01),SOD含量显著升高(P＜0.05)。【结论】EH水提物在猪小肠上皮细胞中通过激活Keap1/Nrf2信号,提高抗氧化酶SOD和GSH-Px含量,启动下游靶基因HO-1表达,发挥抗炎和抗氧化的作用,且10 μg/mL EH水提物作用效果最佳。     

线粒体融合蛋白2基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导巨噬细胞凋亡的影响

[目的] 试验旨在探究线粒体融合蛋白2（MFN2）基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响。[方法] 利用RNA干扰技术设计3条特异性针对MFN2基因的siRNA序列（siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275）和1条阴性干扰序列（siMFN2-Negative）;利用空质粒pcDNA3.1-EGFP通过过表达技术构建1个重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2。双酶切法鉴定过表达重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测筛选最佳干扰序列并鉴定重组质粒的过表达效率,使用筛选出的最佳干扰序列和鉴定过表达后的重组质粒分别构建MFN2基因干扰及过表达的转染巨噬细胞模型;用牛种布鲁氏菌疫苗株A19侵染巨噬细胞,按照细菌数：细胞个数=100：1的比例侵染24 h,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（BAX）的表达情况,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。[结果] 双酶切结果显示,pcDNA3.1-EGFP-MFN2过表达重组质粒构建成功;实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,siMFN2-1661组MFN2的表达极显著降低（P<0.01）,pcDNA3.1-EGFP-MFN2组MFN2的表达极显著增加（P<0.01）,成功构建干扰及过表达MFN2基因的转染巨噬细胞模型;布鲁氏菌侵染干扰MFN2基因表达的巨噬细胞后,BAX蛋白表达水平显著高于siMFN2-Negative组（P<0.05）,BAX转录水平和细胞凋亡率极显著高于siMFN2-Negative组（P<0.01）;布鲁氏菌侵染过表达MFN2基因的巨噬细胞后,BAX的转录及蛋白表达水平均显著低于pcDNA3.1-EGFP组（P<0.05）,细胞凋亡率极显著低于pcDNA3.1-EGFP组（P<0.01）。[结论] 本试验结果表明,干扰MFN2基因的表达会增强布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,而过表达MFN2基因则会抑制布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,结果可为研究MFN2基因的生物学功能提供参考,为进一步解析布鲁氏菌的致病机制提供理论基础。     

不同屠宰活重豫西黑猪的营养成分及肉质特性分析

【目的】探讨豫西黑猪营养成分及肉质性状在不同体重阶段的发育性变化规律。【方法】选取平均体重约为60、75、90、105、120 kg 5个体重阶段的豫西黑猪,每组5头,共25头,每组随机选取3头进行屠宰,公母随机。屠宰后取背最长肌测定眼肌面积、背膘厚、脂肪率、失水率、脂肪酸、氨基酸和胆固醇等指标,测定肌内脂肪含量、脂滴直径和脂滴数目,采集100 g腰大肌测定熟肉率。【结果】豫西黑猪在体重达到120 kg之前,随着屠宰活重的增加,眼肌面积、背膘厚、脂肪率、熟肉率、肌内脂肪含量、肉色、剪切力、脂滴数目和脂滴直径均随之增加。眼肌面积在105、120 kg时均极显著高于60、75 kg(P＜0.01),显著高于90 kg(P＜0.05);背膘厚在90、105、120 kg时均极显著高于60 kg(P＜0.01);肌内脂肪含量在90、105、120 kg时均显著高于60、75 kg(P＜0.05);脂滴直径和脂滴数目在75、90、105、120 kg时均显著高于60 kg(P＜0.05);脂肪酸中饱和脂肪酸以肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸等为主,不饱和脂肪酸以棕榈油酸、油酸、亚油酸等为主,氨基酸种类丰富,组氨酸、酪氨酸、缬氨酸和异亮氨酸含量在120 kg时均显著高于105 kg(P＜0.05)。体重与熟肉率、粗蛋白质、肉色、粗脂肪呈极显著或显著正相关(P＜0.01;P＜0.05);肌内脂肪含量与大理石花纹、粗脂肪、肉色、脂滴直径呈极显著或显著正相关(P＜0.01;P＜0.05)。【结论】屠宰活重在120 kg时,豫西黑猪肌内脂肪含量适中,大理石花纹丰富,不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比例适宜,鲜味氨基酸含量增加,胆固醇含量较低,肉色鲜嫩,胴体品质和肉品质最佳。     

丁酸梭菌对高胆碱饮食小鼠血浆游离脂肪酸组成的影响

【目的】分析丁酸梭菌对高胆碱饮食造成脂代谢异常小鼠血浆游离脂肪酸组成(FFA)的影响,以阐明丁酸梭菌调节高胆碱膳食脂代谢的作用机制。【方法】选取4周龄健康的雄性昆明小鼠24只,随机分为3组:正常组、模型组和丁酸梭菌组,每组8只。高胆碱饮食造模8周后,给药7 d,禁食12 h,采集血浆、肝脏、附睾脂肪垫和肾周脂肪,对肝脏、脂肪称重,利用生化仪检测血脂水平;通过HE染色及油红O染色分别观察肝脏组织结构变化及脂滴沉积程度;利用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术检测小鼠血浆氧化三甲胺(TMAO)含量;利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术及多元统计分析研究血浆中FFA组成。【结果】与模型组相比,丁酸梭菌组小鼠体重、脂肪增长得到显著抑制(P＜0.05),给予丁酸梭菌后小鼠肝脏脂肪沉积减少;丁酸梭菌显著或极显著降低了高胆碱饮食小鼠血浆中甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)含量(P＜0.05;P＜0.01),并使高密度脂蛋白(HDL-C)含量显著升高(P＜0.05);丁酸梭菌灌胃后,高胆碱饮食小鼠血浆TMAO浓度显著降低(P＜0.05);丁酸梭菌可显著降低高胆碱饮食小鼠血浆中棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)等饱和脂肪酸(SFA)含量,显著降低单不饱脂肪酸(MUFA)中棕榈烯酸(C16∶1)、油酸(C18∶1 N9c)含量,显著升高多不饱和脂肪酸(PUFA)中n-3型PUFA含量,其中二十二碳六烯酸(DHA)含量显著升高,n-6型PUFA中亚油酸(C18∶2 N6c)、γ-亚麻酸(C18∶3 N6)含量显著降低(P＜0.05)。此外,丁酸梭菌还显著降低了血浆中反油酸(C18∶1 N9t)、反亚油酸(C18∶2 N6t)含量(P＜0.05)。【结论】服用丁酸梭菌可调节高胆碱饮食小鼠游离脂肪酸组成及血浆TMAO含量,改善其脂代谢紊乱。     

新西兰白兔CYP11A1基因的克隆、生物信息学分析及其对繁殖相关基因的影响

【目的】旨在通过分析细胞色素P450家族成员11A1（CYP11A1）的生物信息功能及其在新西兰白兔卵巢颗粒细胞中对繁殖性能相关基因的调控作用，为探究其在卵泡发育过程中调控功能奠定基础。【方法】根据GenBank上兔CYP11A1基因的序列，设计特异性引物，以新西兰白兔卵巢组织cDNA为模板，PCR扩增并克隆CYP11A1基因序列，构建pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体；用Mega 5.1在线软件构建系统进化树，并通过生物信息学软件对CYP11A1蛋白的氨基酸组成、理化性质、磷酸化位点、保守结构域、二级结构、三级结构、亚细胞定位、蛋白互作进行预测分析。分离新西兰白兔卵巢颗粒细胞，并通过免疫荧光法鉴定颗粒细胞特异性抗体卵泡刺激素受体（FSHR）的表达。设计3条干扰CYP11A1基因表达的引物（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3），筛选出干扰效率最高的1条，并将其与pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体转染到卵巢颗粒细胞中，用实时荧光定量PCR检测颗粒细胞中羟基类固醇17-β脱氢酶1（HSD17B1）、骨形态发生蛋白15（BMP15）和促卵泡刺激素受体（FSHR）等繁殖相关基因mRNA表达水平。【结果】成功克隆新西兰白兔CYP11A1基因，其CDS全长序列为1 557 bp，编码518个氨基酸，其中亮氨酸含量（10.6%）最高，精氨酸（7.6%）、缬氨酸（7.4%）和丙氨酸（7.2%）次之。进化树分析显示，CYP11A1蛋白序列与家鼠、人和猩猩的距离最近。生物信息学分析显示，CYP11A1蛋白理论等电点为7.4，正负电荷残基数各占50个，脂肪族氨基酸指数为82.16，不稳定性指数39.54，其中氨基酸序列中亲水性残基数量多于疏水性残基；CYP11A1蛋白具有40个潜在的磷酸化位点，其中以苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸最为丰富；CYP11A1蛋白二级结构由α-螺旋（48.31%）、无规则卷曲（40.22%）、延伸链（7.42%）和β-转角（4.04%）组成，三级结构为弯曲螺旋状。亚细胞定位预测结果显示，CYP11A1蛋白主要分布于线粒体（52.2%）、细胞质（17.4%）和细胞核（13.0%）中，还具有1个p450家族的结构域，并与多个繁殖性能相关的蛋白（STAR、CYP21A2、CYP17A1和FDX1）相互作用。分离的兔颗粒细胞表达FSHR，可以用于后续试验；CYP11A1基因在颗粒细胞中过表达后，HSD17B1和FSHR基因表达量极显著上调（P＜0.05），BMP15基因表达量显著上调（P＜0.01）；干扰CYP11A1基因表达后，BMP15和FSHR基因的表达量极显著下调（P＜0.01），HSD17B1基因表达量显著下调（P＜0.05）。【结论】CYP11A1是一个稳定、亲水、相对保守且具有抗氧化和类固醇激素合成功能的蛋白。CYP11A1基因可调控卵巢颗粒细胞中与繁殖性能相关的基因HSD17B1、BMP15、FSHR的表达，说明CYP11A1基因在母兔繁殖过程中发挥一定作用。     

多不饱和脂肪酸对动物精液品质影响的研究进展

多不饱和脂肪酸(PUFA)主要分为ω-3 PUFA和ω-6 PUFA,是精子质膜脂质的主要成分,对精子抗氧化、提高精子质膜流动性、维持精子结构完整性及睾酮合成等具有重要作用。不同类型PUFA对精液品质的作用有所不同,ω-6 PUFA中的花生四烯酸(AA)能够促进睾酮的分泌,但精浆中过量的AA可能诱导氧化应激;亚油酸(LA)同样可提高体内睾酮水平,共轭亚油酸(CLA)可降低精子的氧化应激;动物体内少量的二十二碳五烯酸(DPA)不仅能参与精子的运输过程,还能提高精子的抗氧化能力。ω-3 PUFA中的α-亚麻酸(ALA)具有抗氧化作用并能刺激睾酮的合成,二十二碳六烯酸(DHA)作用与ALA相似,可提高精子的抗氧化能力,同时可促进睾酮合成;二十碳五烯酸(EPA)对精子结构及睾酮合成具有调节作用。适当的ω-6/ω-3 PUFA比例对精子的活力、质膜结构、脂质组成和顶体反应均具有重要的调节作用。PUFA对精子的作用可因添加的方式、类型、ω-6/ω-3PUFA的比例及动物种类的不同而有所不同。近年来,PUFA对动物精液品质作用的相关研究取得了较大进展,但其提高精液品质的作用机制仍需进一步深入探讨。作者综述了在饲粮或精液稀释液中添加不同类型的ω-3 PUFA、ω-6 PUFA及ω-6/ω-3 PUFA比例对精子的影响,以期为深入了解PUFA在动物精液生产中的应用提供理论参考。     

发酵穿心莲粉对番鸭生产性能、血清生化指标、免疫相关指标、抗氧化指标及肌肉脂肪酸含量的影响

【目的】本试验旨在研究发酵穿心莲粉对番鸭生产性能、血清生化指标、免疫相关指标、抗氧化指标及肌肉脂肪酸含量的影响。【方法】利用复合菌剂（酵母菌和乳酸菌质量比1：1）发酵穿心莲粉,根据发酵前后成分变化对其微生态功能及药用价值进行分析。将450只15日龄体重250 g左右的黑羽番鸭随机分为5组,每组6个重复,每个重复15只。对照Ⅰ组饲喂基础饲粮,对照Ⅱ组在基础饲粮中添加3%穿心莲粉,发酵Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组分别在基础饲粮中添加1%、3%和5%的发酵穿心莲粉,预试期7 d,正试期48 d。分别于16、21、42、70日龄对番鸭称重,于70日龄从每组随机选取6只番鸭（每个重复随机取1只）屠宰,采集血液、左侧胸肌样品,测定血清生化指标、免疫相关指标及抗氧化指标、肌肉脂肪酸含量。【结果】①穿心莲粉经复合菌剂发酵后,活菌数超过2.0×10⁸ CFU/g,粗纤维含量虽有降低但差异不显著（P>0.05）。②发酵Ⅱ组16~70日龄的料重比显著或极显著低于对照Ⅰ组和发酵Ⅲ组（P<0.05;P<0.01）。③发酵Ⅰ、Ⅱ组的屠宰率均显著高于对照Ⅰ、Ⅱ组（P<0.05）。④发酵Ⅱ、Ⅲ组和对照Ⅱ组番鸭血清的IL-2水平均极显著高于对照Ⅰ组和发酵Ⅰ组（P<0.01）。⑤发酵Ⅱ组的血清丙二醛水平极显著或显著低于对照Ⅰ组和对照Ⅱ组（P<0.01;P<0.05）。⑥发酵Ⅱ组的肌肉不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸及必需脂肪酸含量均显著或极显著高于对照Ⅰ组（P<0.05;P<0.01）。【结论】与基础饲粮组相比,3%发酵穿心莲粉可显著提高番鸭的生产性能、血清IL-2水平、肌肉不饱和脂肪酸和必需脂肪酸含量,减少番鸭脂质过氧化,提高机体抗氧化能力。此外,3%发酵穿心莲粉对番鸭屠宰率和抗氧化能力的影响要显著优于同比例未发酵穿心莲粉。     

miR-145-4调控蛋鸭卵泡发育机制的研究

【目的】 本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制。【方法】 分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物（mimic）、抑制物（inhibitor）后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunit α,PIK3CA）3'-UTR的结合位点,分别构建PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞后,采用双荧光素酶报告系统验证miR-145-4与靶基因PIK3CA的结合关系,最后采用实时荧光定量PCR法检测miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞中PIK3CA基因表达的影响。【结果】 实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达miR-145-4后CyclinB2基因的表达量极显著降低（P<0.01）,BCL2基因的表达量极显著增加（P<0.01）;抑制miR-145-4后,CyclinB2基因表达量极显著升高（P<0.01）,BCL2基因表达量极显著降低（P<0.01）。预测结果显示,miR-145-4与PIK3CA基因3'-UTR存在结合位点。PCR扩增和测序结果显示,PIK3CA基因3'-UTR的野生型和突变型载体构建成功。双荧光素酶检测结果显示,与突变型及空载体共转染组相比,野生型组双荧光素酶活性显著降低（P<0.05）,说明miR-145-4能够与PIK3CA基因3'-UTR结合。实时荧光定量PCR结果表明,在蛋鸭卵泡颗粒细胞中过表达miR-145-4后,PIK3CA基因表达量显著降低（P<0.05）,而抑制miR-145-4后,PIK3CA基因表达量极显著升高（P<0.01）。【结论】 miR-145-4通过正向调控靶基因PIK3CA促进蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡,进而调控蛋鸭的卵泡发育。     

健脾消导中药复方对6月龄西杂牛生长性能、瘤胃发酵参数和血清指标的影响

【目的】研究健脾消导中药复方对6月龄西门塔尔牛×本地黄牛杂交犊牛（西杂牛）生长性能、瘤胃发酵参数和血清生化指标的影响。【方法】选取体重为193 kg±20 kg的西杂牛28头,随机均分为对照组和试验组。对照组饲喂基础饲粮,试验组在基础饲粮中添加0.5%健脾消导中药复方,预试期7 d后连续饲喂90 d,于第91天晨饲前称重并采集瘤胃液和血液,测定瘤胃液短链脂肪酸和血清生理生化指标。【结果】与对照组相比,试验组平均日增重（ADG）显著增加（P＜0.05）,料重比（F/G）降低;瘤胃液pH、乙酸、丙酸、丁酸、总短链脂肪酸含量及乙酸/丙酸比值均无显著差异（P＞0.05）;血清总胆固醇（CHO）含量升高;总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、谷丙转氨酶（ALT）和丙二醛（MDA）含量均显著降低（P＜0.05）;免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、胃泌素（GAS）、三碘甲状腺原氨酸（T₃）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量均显著升高（P＜0.05）;胃动素（MTL）和生长激素（GH）含量虽有升高但均差异不显著（P＞0.05）。【结论】在6月龄西杂牛的饲粮中添加健脾消导中药复方可以调节激素分泌、促进草料消化吸收、增强抗氧化能力、提高机体免疫力,进而提升西杂牛的生长性能。     

4种中药单体与丁酸钠诱导猪宿主防御肽表达的协同效果研究

【目的】研究中药单体黄腐酚、异丹叶大黄素、去氧紫草素和毛蕊异黄酮与丁酸钠诱导猪宿主防御肽(host defense peptides,HDPs)表达的协同效果。【方法】中药单体黄腐酚、异丹叶大黄素、去氧紫草素和毛蕊异黄酮与丁酸钠单独或共同处理猪肠上皮细胞IPEC-J2和猪肺泡巨噬细胞3D4/31,通过测定HDPs的基因表达、细胞因子基因表达,以及细胞对产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的抑菌作用,评估中药单体与丁酸钠协同诱导HDPs表达的效果。【结果】黄腐酚与丁酸钠共同处理对HDPs的表达不表现协同作用;异丹叶大黄素与丁酸钠共同处理可协同诱导IPEC-J2细胞pEP2C和pBD3基因的表达(P＜0.01);去氧紫草素与丁酸钠共同处理可协同提高IPEC-J2细胞内pBD3和PG1-5基因的表达(P＜0.05;P＜0.01);毛蕊异黄酮与丁酸钠共同处理可协同促进IPEC-J2细胞内PG1-5、pEP2C、pBD2和pBD3基因(P＜0.05;P＜0.01)和3D4/31细胞内pBD3基因的表达(P＜0.05)。中药单体与丁酸钠共同处理对细胞因子表达无显著协作效果(P＞0.05)。除黄腐酚外,其他中药单体与丁酸钠单独或共同处理后均可提高细胞裂解产物对ETEC的抑菌能力,其中毛蕊异黄酮与丁酸钠处理对ETEC的抑制具有最佳协同效果。【结论】异丹叶大黄素、去氧紫草素和毛蕊异黄酮与丁酸钠在诱导HDPs表达、提高机体免疫和抗菌能力方面具有一定的协同作用。