藏猪促红细胞生成素的表达与低氧适应分析

为了解藏猪肾脏中促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）的表达与其低氧适应之间的关系,采用Western blotting技术检测西藏林芝地区（海拔约3000 m）的高海拔藏猪（ZZ）和高海拔大约克夏猪（YZ）、北京中顺景盛养殖场（海拔约100 m）的低海拔藏猪（ZB）和安徽合肥市（海拔约为36 m）的低海拔大约克夏猪（YH）肾脏组织EPO蛋白的表达量。结果发现,ZZ、ZB、YZ、YH的EPO表达量,在A组试验中,高海拔藏猪与高海拔大约克夏猪差异显著（P<0.05）,高海拔大约克夏猪与低海拔藏猪、低海拔大约克夏猪差异极显著（P<0.01）;B组试验中,高海拔藏猪与低海拔藏猪差异不显著（P>0.05）,高海拔藏猪与高、低海拔大约克夏猪差异显著（P<0.05）;C组试验中,高、低海拔藏猪间差异显著（P<0.05）,低海拔藏猪与高、低海拔大约克夏猪差异极显著（P<0.01）。当大约克夏猪处在高海拔应急状态下时,EPO的表达量高于藏猪。而长期生活在高原的大约克夏猪EPO的表达量较藏猪低,但高于低海拔大约克夏猪。EPO的稳定表达是藏猪适应高原低氧环境的一个重要因素,而高原大约克夏猪肾脏组织内EPO的高表达,则是大约克夏猪适应高原低氧环境的生理调节过程。     

藏猪促红细胞生成素(EPOR)基因的表达与低氧适应分析

为了解促红细胞生成素受体(EPOR)对动物低氧适应的重要作用,试验选取饲养在西藏林芝(海拔约3 000 m)的高原藏猪、高原大约克猪和饲养在北京(海拔约100 m)的大约克猪(低地大约克猪),在6月龄进行屠宰,采集心脏、肝脏和肺脏器官组织,使用荧光定量PCR技术测定EPOR基因的表达量。结果表明:猪EPOR基因在肺脏器官组织中表达量比较高,在心脏和肝脏器官组织中表达量较低。高原藏猪EPOR基因的表达量在3个器官组织中均高于高原大约克猪和低地大约克猪,但在肺脏器官组织中高原藏猪与高原大约克猪相比差异不显著(P0.05)。大约克猪从低地移居到高原地区,器官组织中EPOR基因表达量均显著增加(P0.05)。EPOR基因是受低氧调控的基因,低地大约克猪移居到高原之后该基因表达量增加;高原藏猪EPOR基因表达量高于大约克猪,可能对其高原适应性具有重要作用。     

藏猪EPAS1基因低氧适应相关位点与表达量研究

为了研究EPAS1基因编码区的遗传变异与藏猪高海拔低氧适应的相关性,选取藏猪、撒坝猪、滇南小耳猪和欧系杜洛克猪各10头,提取血液DNA筛选EPAS1基因低氧优势位点,利用实时荧光定量PCR方法和免疫组织化学试验技术检测EPAS1基因mRNA和蛋白表达量。基因频率检测确定藏猪优势SNP有21个,其中6个呈现海拔趋势,但连锁不平衡程度并未呈现海拔趋势,位点间未检测到正选择的搭载效应,结果提示EPAS1基因在藏猪群中可能不受低氧正选择。藏猪EPAS1基因mRNA和蛋白表达水平正常,未呈现低氧适应性表达。研究结果表明藏猪具有不同于其他高原动物的低氧适应机制,有待进一步研究。     

藏猪与连续海拔分布猪种血常规及血流变学指标研究

试验以迪庆藏猪和分布在连续海拔梯度的土著猪种(丽江猪、保山猪、德宏小耳猪)为研究对象,共采集228份血液样品,测量血液生理和血流变学指标共16项。结果显示藏猪红细胞数(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)均极显著高于德宏小耳猪(P<0.01),增加了血红蛋白运氧能力。藏猪全血黏度和血浆黏度均高于低海拔德宏小耳猪(P<0.05),但藏猪红细胞聚集性极显著低于其他猪种(P<0.01),从而钝化由RBC和HGB增加带来血液黏度增加的不良影响,以适应高原低氧的环境。从4个海拔梯度看,血常规指标和血流变学指标大都呈现随海拔升高而升高的趋势,表明这两类指标与藏猪高海拔适应相关。     

藏猪和大约克夏猪RBP5基因多态性及表达差异性分析

视黄醇结合蛋白5(RBP5)是视黄醇结合蛋白家族新成员,在脂肪代谢中有重要作用。为探索RBP5基因在猪生长发育、脂肪代谢性状中的相关性,本实验选取180日龄藏猪和大约克夏猪,在mRNA水平上对藏猪、大约克夏猪的肝脏、肾脏和腹脂组织中的RBP5基因表达量进行了RT-qPCR检测,在DNA水平上对藏猪、大约克夏猪RBP5基因3’侧翼区、5’侧翼区和CDS区进行了单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)位点筛选。2个品种猪肝脏、肾脏和腹脂中RBP5基因的mRNA相对表达量趋势基本一致,藏猪肝脏、肾脏中RBP5的表达量极显著低于大约克夏猪,腹脂中的表达量显著低于大约克夏猪,表明RBP5基因可能与脂肪沉积能力呈负相关;RBP5基因在3’侧翼区有’G²⁷⁴A、’T²⁷⁸C和’C³⁴⁶T 3个突变位点,藏猪与大约克夏猪存在极显著差异。本研究中RBP5基因的’G²⁷⁴A、’T²⁷⁸C、’C³⁴⁶T位点的多态性与mRNA表达差异...     

云南乌金猪与约大乌猪低氧适应性的研究

旨在探明云南高原乌金猪与约大乌猪低氧适应差异。采集60日龄乌金猪与约大乌猪各30头(公母各半)血样,检测乌金猪和约大乌猪血液血红蛋白含量(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞数目(RBC)、平均血红蛋白含量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)和氧饱和度生理表征参数。屠宰60日龄乌金猪与约大乌猪各12头(公母各半),采用Real-time PCR方法检测心、肝、肺、肾、空肠、回肠、十二指肠、皮肤、肌肉、胰腺、睾丸或卵巢12种组织中HIF-1α、VEGF、EPO基因的表达。结果显示,乌金猪HGB和RBC极显著(P0.01)高于约大乌猪,而HCT和MCH低于约大乌猪,乌金猪氧饱和度高于约大乌猪,但差异不显著(P0.05)。在乌金猪与约大乌猪的各个组织中均检测到HIF-1α、VEGF、EPO基因mRNA的表达;在低氧适应基因中,HIF-1α基因在肝、肺、胰腺、肾和皮肤组织表达量最高,VEGF基因在肝、肺和胰腺表达量最高,EPO基因在肾和肝表达量最高;HIF-1α、VEGF、EPO基因在两猪种中的表达量趋势一致,约大乌猪组织中的总体表达量高于乌金猪的表达量;母猪低氧适应基因的总体表达量显著高于公猪。乌金猪低氧适应生理表征参数明显高于约大乌猪,在多数组织约大乌猪低氧适应基因的表达高于乌金猪。但对其高原低氧适应性机制有待进一步研究。     

基于iTRAQ技术挖掘猪肾组织高原低氧适应性关键蛋白

旨在探究高原低氧环境下藏猪与大约克猪肾组织中低氧适应的差异表达蛋白（differentially expressed protein,DEPs）。本试验选择藏猪与大约克猪两个品种无亲缘关系的去势公猪,饲养于海拔3 000 m的高原,按自由采食方式饲养至180日龄,每个品种随机选择生长情况相近的 9头猪采集肾组织。利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ）技术对藏猪和大约克猪肾组织中蛋白差异表达情况进行分析,并对差异表达蛋白进行GO（Gene Ontology）功能注释及KEGG通路分析。结果发现,在两猪种肾脏组织中共获得4 370个蛋白质,以FC>1.2或<0.833,P<0.05为筛选条件共筛选出181个DEPs,其中在藏猪中上调的蛋白质有138个,下调的有43个。这些DEPs主要功能富集在HIF-1信号通路、PPAR信号通路、补体和凝血级联信号通路、氧化还原酶活性、碳代谢、血压调节、线粒体等与低氧适应相关的条目和通路上,进一步综合分析后共筛选出5个与低氧适应相关的重要DEPs（CD59、A2M、eNOS、CDKN1B和PGK1）。这些DEPs分别在维持血液动力学、调节能量代谢与生理环境稳态等方面的调节中起到重要作用,为进一步研究猪的高原低氧适应性提供一定理论依据。     

藏猪EGLN1基因exon 4及部分内含子变异研究

青藏高原的高寒低氧极端环境影响动物的正常生存和物种繁衍,藏猪在长期的适应性驯化中对低氧环境有着更强的适应能力。本研究对高海拔猪种藏猪(甘孜藏猪、迪庆藏猪、西藏藏猪和合作藏猪)和八眉猪以及低海拔猪种烟台黑猪、长白猪和大白猪EGLN1基因exon 4及部分内含子的核苷酸序列进行测定和分析。结果表明:在EGLN1基因exon 4序列的266bp处发生了C→T的颠换,藏猪和八眉猪在该位点均为C,而烟台黑猪和引入的选育猪种长白猪、大白猪在该位点出现了C/T杂合现象;基于变异位点的等位基因C和T共界定了3种基因型(CC、CT、TT),C和CC分别是高海拔地方猪种藏猪和八眉猪的唯一等位基因和基因型;而在低海拔选育猪种中,CC基因型频率仅为0.20,其他2种基因型均为0.40,T为优势等位基因,频率达到0.60,而等位基因C的频率仅为0.40。本研究认为,高海拔猪种(2 300 m以上)藏猪和八眉猪与低海拔猪种烟台黑猪、长白猪和大白猪在EGLN1基因上存在特征性遗传变异,根据等位基因(C和T)及基因型(CC、CT、TT)在海拔上的特征差异,推测可能与不同地理区域条件下的长期适应性驯化有关。     

IGF-1和PPARγ在不同猪种皮下脂肪中的差异表达研究

为了研究mRNA表达量与猪胴体及肉质性状的相关性,试验采用荧光定量PCR技术(QRT-PCR)检测了引进猪种大约克夏猪和6个四川省地方猪种背部皮下脂肪中IGF-1和PPARγ的差异表达情况。结果显示:大约克夏猪IGF-1相对表达量显著或极显著高于所有地方猪种(P0.05或P0.01),地方猪种中藏猪最高,显著高于丫杈猪、内江猪、青峪猪(P0.05);大约克夏猪PPARγ相对表达量极显著高于青峪猪、藏猪(P0.01),显著高于雅南猪(P0.05),地方猪种中成华猪、丫杈猪显著高于青峪猪和藏猪(P0.05)。相关分析显示,IGF-1、PPARγ分别与体脂率呈极显著和显著负相关(P0.01,P0.05),与多不饱和脂肪酸含量呈极显著正相关(P0.01);此外,IGF-1与单不饱和脂肪酸含量呈极显著负相关(P0.01),PPARγ与肌内脂肪含量呈显著负相关(P0.05)。     

不同品种猪感染HP-PRRSV后肺组织间PRRSV受体基因差异表达的研究

为进一步了解藏猪、藏梅猪和大约克夏猪对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRSV） JXA1分离株具有不同易感性的分子机理,本研究建立实时荧光定量RT-PCR方法比较分析藏猪、藏梅猪和大约克夏猪感染JXA1分离株前、感染后4、7和14 d肺脏中HSPG2、SIGLEC1、CD163、VIM和NMMHC-ⅡA 5个PRRSV受体基因的差异表达情况。结果显示,藏猪感染JXA1分离株后4和14 d肺脏中HSPG2的表达量显著高于感染前（P < 0.05）,而感染后7 d HSPG2的表达量显著低于感染前（P < 0.05）,藏梅猪在感染后14 d HSPG2的表达量显著高于感染后7 d（P < 0.05）;藏猪感染后4和14 d肺脏中SIGLEC1的表达量显著高于感染前（P < 0.05）,大约克夏猪感染后4、7和14 d SIGLEC1的表达量均显著低于感染前（P < 0.05）;藏猪和藏梅猪感染后14 d肺脏中CD163的表达量均显著高于感染前（P < 0.05）,大约克夏猪则感染后7和14 d均显著低于感染前（P < 0.05）;藏猪感染后7 d肺脏中VIM的表达量显著高于感染前（P < 0.05）,大约克夏猪在感染后7 d显著低于感染前（P < 0.05）;藏梅猪感染后4 d肺脏中NMMHC-ⅡA的表达量显著高于感染前（P < 0.05）,大约克夏猪在感染后4和14 d NMMHC-ⅡA的表达量显著高于感染前（P < 0.05）。结果表明,5个PRRSV受体基因中,SIGLEC1和VIM基因可能是影响藏猪、藏梅猪和大约克夏猪对JXA1分离株易感性存在差异的潜在关键基因。     

藏猪和长白猪心脏血管铸型结构差异性分析

阐明藏猪和长白猪心脏血管铸型结构差异,为揭示藏猪适应高海拔低氧环境的生物学机制提供理论参考。采集甘南藏猪、移居至泾川的藏猪、移居到永登的长白猪和泾川长白猪等不同生长环境下的心脏组织,采用ABS[丙烯腈(A)、丁二烯(B)、苯乙烯(S)三种单体的三元共聚物]灌注剂制作血管铸型,并通过扫描电镜观察分析心脏血管铸型特征。结果显示,藏猪心脏前室间支的内侧血管较长白猪发达,且枝干上有较多小动脉,长白猪前室间支内径与藏猪相比差异显著(P0.05);藏猪心脏大静脉血管走形较为弯曲且伸展覆盖整个铸型面积较长白猪广,长白猪心大静脉内径与藏猪相比差异显著(P0.05);通过分析不同群体心脏前室间支及心大静脉管径与心脏质量的相对值(T/W)发现,藏猪群体T/W值均显著高于长白猪群体(P0.05),较高海拔的甘南藏猪群体、永登长白猪群体的T/W值均分别高于较低海拔的泾川藏猪群体和泾川长白猪群体,但差异均不显著。扫描电镜观察发现,长白猪心脏微血管铸型表面分布有较浅的平滑肌纤维压痕,偶尔可见卵圆形的内皮细胞核压痕,而藏猪心脏微血管铸型表面呈现"环形缩窄"与内皮细胞核压痕伴行特征。说明同长白猪相比,藏猪对血流的调节能力更强,拥有更强的供血能力,这可能是藏猪为适应高海拔环境长期进化的结果。     

EPO在高原藏羊和平原绵羊睾丸组织中的差异性表达

为揭示促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）在高原藏羊和平原绵羊睾丸组织中的表达差异，本研究采集藏羊和绵羊的睾丸组织，采用H&E染色法观察二者睾丸组织的形态结构，采用免疫组织化学染色法对藏羊和绵羊睾丸组织中EPO表达分布差异性进行分析。H&E结果显示，藏羊和绵羊睾丸组织结构均正常，绵羊生精小管形状较藏羊更为规则，且生精上皮细胞数量较多。免疫组化结果显示，藏羊和绵羊的睾丸组织中均能检测出EPO，但EPO在藏羊睾丸组织中的表达量高于绵羊睾丸组织。由此看来，藏羊在长期适应高原低氧环境的过程中，生殖器官组织结构发生了一定适应性变化，EPO在藏羊睾丸组织中的表达程度高于绵羊睾丸组织，对藏羊睾丸低氧适应性有重要调控作用，说明EPO可能与藏羊在高原环境下维持正常繁殖性能有关。     

藏猪睾丸DNA甲基化与HIF2α基因mRNA表达水平的相关性

对藏猪睾丸组织基因组DNA甲基化水平与Dnmt3a、HIF2α基因mRNA表达水平的相关性进行研究。以大约克猪为对照,采用荧光法测定藏猪睾丸组织基因组DNA甲基化水平,采用实时荧光定量PCR技术测定DNA甲基化转移酶3a(Dnmt3a)与低氧诱导因子2α(HIF2α)的基因在藏猪睾丸组织中mRNA表达水平。结果显示:藏猪睾丸基因组DNA甲基化水平(0.392 9±0.099 2)%显著低于大约克猪睾丸基因组DNA甲基化水平(0.901 7±0.146 7)%(P<0.05);藏猪睾丸组织中Dnmt3a基因mRNA相对表达量(0.071 6±0.036 6)%显著低于大约克猪睾丸组织中Dnmt3a基因mRNA相对表达量(0.987 8±0.137 0)%(P<0.05);藏猪HIF2α基因mRNA相对表达量(0.158 8±0.066 1)%也显著低于大约克猪HIF2α基因mRNA相对表达量(1.2930±0.0756)%(P<0.05)。通过对藏猪睾丸基因组DNA甲基化水平与该组织中Dnmt3a和HIF2α基因mRNA表达量进行相关性分析,发现存在线性正相关,R2值分别达到0.846 3和0.917 4,这将为藏猪睾丸低氧适应性的DNA甲基化机制及藏猪的分子育种等相关研究奠定基础。     

猪DECR1基因在不同猪种及组织中的差异表达研究

DECR1是脂肪酸代谢途径中的关键限速酶,可作为猪脂肪沉积和肉质性能的候选基因。本研究采用实时荧光定量PCR技术测定了藏猪、滇南小耳猪和大约克夏猪肌肉、背膘和腹脂组织中DECR1基因mR NA表达量。结果表明:藏猪和滇南小耳猪脂肪组织中DECR1基因表达显著高于大约克猪(P<0.05),而肌肉组织中该基因表达品种间差异不显著(P<0.05)。研究结果表明,猪DECR1基因在脂肪组织中的表达量可能与该品种脂肪沉积能力和肉质性能有关。     

中外不同猪种皮下脂肪miR-128、miR-133b差异表达研究

为了研究miRNA表达量与猪胴体及肉质性状的相关性,试验采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对引进猪种大约克夏猪和6个四川省地方猪种(丫杈猪、内江猪、成华猪、青峪猪、雅南猪和藏猪)背部皮下脂肪中miR-128和miR-133b的差异表达情况进行测定和分析。结果表明:大约克夏猪miR-128相对表达量显著或极显著高于除雅南猪以外的其余地方猪种(P0. 05或P0. 01),地方猪种中雅南猪miR-128相对表达量最高,显著高于丫杈猪(P0. 05);大约克夏猪miR-133b相对表达量最高,显著高于青峪猪(P0. 05),地方猪种间差异不显著(P0. 05)。相关分析结果表明,miR-128、miR-133b与瘦肉率呈显著正相关(P 0. 05),miR-128与单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸含量分别呈极显著负相关(P0. 01)和极显著正相关(P0. 01)。说明miR-128和miR-133b可能对猪脂肪沉积有抑制作用,miR-128还可能抑制单不饱和脂肪酸的生成,促进多不饱和脂肪酸的生成。     

不同猪种背部皮下脂肪中miR-1和miR-369的表达差异及其与胴体、肉质性状相关性分析

为了研究miRNA表达量与猪胴体及肉质性状的相关性,采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测了引进猪种大约克夏猪和6个四川省地方猪种背部皮下脂肪中miR-1和miR-369的差异表达情况。结果:除miR-1与藏猪差异不显著外,2种miRNA在大约克夏猪背部皮下脂肪中的表达水平显著高于地方猪种(P<0.05);地方猪种中,miR-1和miR-369表达水平分别在藏猪和雅南猪中最高;相关性分析显示,miR-1和miR-369在背部皮下脂肪中表达水平均与瘦肉率、多不饱和脂肪酸含量呈极显著正相关(P<0.01),与单不饱和脂肪酸含量均呈显著负相关(P<0.05),miR-369表达水平还与平均背膘厚呈极显著负相关(P<0.01)。试验表明miR-1和miR-369可能对猪脂肪沉积和单不饱和脂肪酸生成起负调控作用,对多不饱和脂肪酸生成起正调控作用。     

不同猪种背最长肌中miR-27a和miR-378的差异表达研究

为了研究miRNA表达量与肉质风味表型指标的相关性,试验采用实时荧光定量PCR(qRTPCR)检测了藏猪和大约克夏猪背最长肌中miR-27a、miR-378的差异表达。结果表明:藏猪在6月龄时背最长肌中miR-27a和miR-378的表达量均极显著低于大约克夏猪(P0.01)。相关性分析显示,miR-27a、miR-378与肌内脂肪含量和硫胺素呈负相关,而与肌纤维直径、眼肌面积和瘦肉率呈显著或极显著正相关(P0.05或P0.01)。说明miR-27a和miR-378对猪肉品质具有重要的负调控作用。     

高原牦牛肺脏组织诱导型一氧化氮合酶基因表达分析

为了阐明高原牦牛诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达对高原牦牛肺脏组织低氧适应作用的影响,试验采用实时荧光定量PCR方法,对不同品种、不同海拔高度的牦牛iNOS的mRNA相对表达量进行相关分析。结果表明:iNOS在转录水平上总体表现为随海拔的升高而升高的趋势,且父本来自海拔5 000 m以上的大通牦牛肺脏组织的iNOS mRNA相对表达量最高。说明牦牛iNOS mRNA相对表达量与海拔和品种均有一定的相关性。     

石河子地区引入藏猪血液生理生化指标的初步研究

藏猪是青藏高原特有的地方种猪。为了了解石河子地区引入的藏猪对本地区的环境适应性,本研究利用全自动血球计数仪和全自动生化仪对2~3月龄引入藏猪血液的部分生理和生化指标进行测定,并与原产地饲养的高原藏猪血液指标进行比较。结果显示,引入藏猪的血小板、葡萄糖水平远高于高原藏猪;红细胞数、血红蛋白、白细胞数、红细胞比容、谷丙转氨酶、总蛋白、白蛋白、总胆固醇高于高原藏猪;引入藏猪谷草转氨酶远低于高原藏猪;尿素氮、肌酐、三酰甘油略低于高原藏猪。引入藏猪已经基本适应本地区的环境。     

不同地方猪种背部皮下脂肪中miR-206差异表达研究

试验采用荧光定量PCR技术(QRT-PCR)对6个四川省地方猪种背部皮下脂肪中miR-206的差异表达情况进行测定和分析。结果表明:藏猪miR-206相对表达量最高,成华猪次之,青峪猪最低;藏猪miR-206相对表达量显著高于内江猪(P<0.05),极显著高于丫杈猪和青峪猪(P<0.01)。