猪流行性腹泻病毒N蛋白与Vero E6核仁蛋白Fibrillarin的亚细胞定位分析

为鉴定猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与Vero E6细胞核仁fibrillarin蛋白的亚细胞定位的特征.本实验参照GenBank中人细胞fibrillarin基因(M59849.1)序列,设计并合成特异性引物,利用RT-PCR方法扩增了Vero E6细胞的fibrillarin基因,并将其克隆于真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed-Fib.将pDsRed-Fib与本实验室构建的含有PEDV N基因的重组质粒pAcGFP-N,共转染Vero E6细胞.Western blot结果表明fibrillarin及N融合蛋白在转染的Vero E6细胞中均获得表达;利用共聚焦显微镜观察显示在共转染Vero E6细胞中PEDV N蛋白与Vero E6细胞核仁中的fibrillarin发生共定位.该结果为进一步研究PEDV和核仁蛋白相互作用奠定基础.     

赤羽病病毒核衣壳蛋白基因的表达纯化及活性鉴定

为获得赤羽病病毒（Akabane virus, AKAV）核衣壳蛋白重组抗原,经RT-PCR扩增了OBE-1株的S节段,将其插入到pMD 18-T载体,然后用带有酶切位点的引物从该重组载体亚克隆出表达核衣壳蛋白的N基因,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样处理的表达载体pET-28a（＋）进行连接,转化感受态细胞BL21（DE3）.将筛选出的阳性克隆进行测序、IPTG诱导表达和融合蛋白纯化及活性鉴定.结果表明,N基因含有1个全长702 bp的ORF,编码233个氨基酸,通过SDS-PAGE和Western-blotting分析,证实重组菌株可高效表达有免疫活性的分子质量约27 ku的可溶性融合蛋白,用薄层扫描仪分析,其最高表达量占可溶性菌体蛋白总量的58.5%.工程菌经超声波裂解高速离心后,上清液在ProBondTM Purification System（含Ni2＋）天然状态下纯化,可获得高纯度的融合蛋白.     

贵州白香猪γ-干扰素真核表达质粒的构建

为了构建贵州白香猪γ-干扰素真核表达载体,试验以已构建的含有γ-干扰素基因的pMD-GZ-IFN-γ质粒为模版,利用特异性引物进行PCR扩增,得到大小为501 bp的γ-干扰素基因的开放阅读框,将所得IFN-γ基因克隆至经相同双酶切处理后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-IFN-γ。测序结果表明：克隆至pcDNA3.1（＋）的基因序列为γ-干扰素序列,说明γ-干扰素基因真核表达载体构建成功。     

稳定表达小反刍兽疫病毒衣壳蛋白的Vero细胞系的筛选和鉴定

本研究利用PCR方法扩增小反刍兽疫病毒(PPRV)的衣壳蛋白(N蛋白)基因,并将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-pN.利用电转的方法将该重组质粒转入非洲绿猴肾(Vero)细胞,并使用抗生素G418进行筛选.Western blot试验结果表明,N基因在Vero细胞中得到了表达,且...     

新孢子虫SAG1-SRS2融合基因真核表达质粒的构建及表达

根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)ZZ2004株核衣壳蛋白基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的核衣壳蛋白（N）。根据IBV ZZ2004株的N基因设计1对引物,提取IBV ZZ2004株的RNA,利用RT-PCR技术扩增大小约1.23 kb的片段,将其插入克隆载体pGEM-T构建pGEM-T-N。将pGEM-T-N用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pGEX-6P-1,转入大肠杆菌BL21（DE3）菌中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳,结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白;Western blotting检测结果显示N蛋白可与相应的IBV ZZ2004阳性血清发生特异性反应,结果表明N蛋白有一定的生物活性。本研究为IBV诊断试剂盒及新型IBV重组亚单位疫苗研制奠定基础。     

牛副流感病毒3型核衣壳蛋白基因的真核表达

根据牛副流感病毒3型(BPIV-3)内蒙09株(NM09)全基因组序列(GenBank登录号:JQ063064)设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增出牛副流感病毒3型分离株的核衣壳蛋白(N)基因,通过NheI和NotI限制性内切酶位点亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+),获得真核重组质粒pcDNA3.1-N。采用Superfect转染试剂将重组质粒转染至BSR细胞中,转染后的BSR细胞经间接免疫荧光试验和RT-PCR方法检测,重组质粒pcDNA3.1-N在BSR细胞中能正确表达N蛋白。本研究结果为BPIV-3新型疫苗的研制奠定基础。     

EB和CVN抗病毒肽对PRRSV入侵细胞的抵抗作用

为了研究EB抗病毒肽和蓝藻抗病毒蛋白-N(CVN)抗病毒肽抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的入侵作用,对分别转染了不同载体(未转染组、pcDNA3.1空载体组、pcDNA3.1-MSTNpro组、pcDNA3.1-MSTNpro-EB组和pcDNA3.1-MSTNpro-CVN组)的猴肾细胞(Marc-145细胞)进行PRRSV处理,检测病毒核衣壳N蛋白与细胞波形蛋白的mRNA表达差异。结果表明:在PRRSV处理后,与pcDNA3.1-MSTNpro组相比,pcDNA3.1-MSTNpro-EB组和pcDNA3.1-MSTNpro-CVN组中病毒核衣壳N蛋白和细胞波形蛋白的mRNA相对表达量极显著或显著降低(P0.01或P0.05)。说明EB抗病毒肽和CVN抗病毒肽具有抗PRRSV入侵细胞的作用。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDV N蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDV N基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-C1连接,构建重组质粒pAc-GFP-dN。将pAc-GFP-dN转染于Vero E6细胞中,利用激光共聚焦显微镜分析重组质粒pAc-GFP-dN表达蛋白的定位情况,并利用流式细胞仪检测转染细胞的周期变化。实验结果表明:与完整的N蛋白相比,缺失核仁定位信号的N蛋白不能定位于细胞核仁,同时丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力,从而揭示了N蛋白核仁定位信号对宿主细胞具有重要的影响。     

猪流行性腹泻病毒蛋白对Vero E6核蛋白B23.1的影响

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)核蛋白N对Vero E6细胞核仁蛋白B23.1的影响,将本实验室构建的DsRed-N1/B23.1重组质粒转染Vero E6细胞,转染6h后接种PEDV,分别在转染后12、18h和24h三个时间点,进行病毒感染细胞的间接免疫试验,同时设未感染对照组,而后利用激光共聚焦显微镜分析感染和转染细胞中B23.1蛋白的变化。结果表明,PEDV N蛋白与Vero E6核蛋白B23.1有共定位特征,在PEDV感染Vero E6细胞12h后,B23.1蛋白开始发生变化,随着时间的延长逐渐碎裂、分散。这个结果提示,病毒可能通过破坏核仁的结构和核仁蛋白的功能,进而为病毒的复制提供便利。