苜蓿花叶病毒和白三叶草花叶病毒复合侵染本氏烟的发病流行因素

为明确苜蓿花叶病毒(AMV)和白三叶草花叶病毒(WCMV)在室内条件下复合侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)的发病流行因素，以接种磷酸缓冲盐溶液(PBS)的本氏烟为对照，通过对AMV和WCMV单独接种侵染、复合侵染的不同接种浓度、不同温度和相对湿度(RH)对本氏烟发病的影响及本氏烟中两种病毒含量变化进行了研究。结果表明最适合本氏烟发病的AMV和WCMV单独接种浓度分别为20%(AMV:PBS=1:4)和50%(WCMV:PBS=1:1)，两种病毒复合侵染接种的浓度为75%和25%(AMV:WCMV=3:1)；最适宜发病的温度为25℃、RH为60%，在此条件下，AMV和WCMV复合接种侵染本氏烟的平均病情指数为80.12，比单独接种AMV、WCMV的病情指数分别提高了22.36%、45.28%，其病毒含量是两种病毒单独接种本氏烟中的2.11和1.60倍。综上可见，当温度为25℃、RH为60%以及AMV和WCMV复合侵染接种浓度为75%和25%时，本氏烟发病最严重。     

甘肃省张掖地区苜蓿花叶病病原的检测

2011年7月在甘肃省张掖地区发现发生花叶病的苜蓿田块,地块中病株呈现黄斑花叶、叶柄扭曲及整株矮化的症状。为明确其病原,采集病株后利用血清学和分子生物学方法对病样进行了检测。 DAS-ELISA、RT-PCR-RFLP及病毒CP基因序列测定分析结果表明,苜蓿病样受到番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)和苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)的复合侵染。这是国际上首次报道番茄花叶病毒对苜蓿的侵染,讨论了由这两种病毒引致病害的发生与防治。     

紫花苜蓿病毒病症状类型及病原检测

本研究为了探明甘肃省兰州市紫花苜蓿(Medicago sativa)侵染病毒病的症状类型、病原种类以及寄主范围,进行了田间调查和室内酶联免疫检测。田间调查确定了苜蓿病毒病在兰州市安宁区和皋兰县以及白银市景泰县均有发生,其中景泰县的发病率和病情指数均最高,分别为43.33%和26.08;共采样90份,检查30份,检查比例为30%。检测到的病原有苜蓿花叶病毒(AMV)、白三叶草花叶病毒(WCMV)、菜豆黄花叶病毒(BYMV)和豇豆花叶病毒(CPMV)4种,检出率分别为100.00%、50.00%、75.00%和75.00%,且存在复合侵染现象,复合侵染率达50.00%;寄主范围测定供试植物共6科17属18种,经测定,AMV可以侵染6科15种植物,WCMV可以侵染4科8种植物,BYMV和CPMV可以侵染3科7种植物,4种病毒可复合侵染6科14种植物。     

苜蓿花叶病毒和白三叶草花叶病毒复合侵染对本氏烟中5种激素含量的影响

为探明苜蓿花叶病毒(alfalfa?mosaic?virus,?AMV)和白三叶草花叶病毒(white?clover?mosaic?virus,?WCMV)复合侵染的协生作用致病机理,以复合接种AMV+WCMV的本氏烟为处理,分别以单独接种AMV、WCMV、磷酸盐缓冲溶液(pH?7.0,?PBS)的本氏烟为对照,采用DAS-ELISA?(double-antibody?sandwich?enzyme-linked?immunosorbent?assay)方法检测了接种病毒72?h的本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中的病毒含量及72～720?h内水杨酸(salicylic?acid,?SA)、茉莉酸(jasmonic?acid,?JA)、独脚金内酯(strigolactones,?SLs)、油菜素内酯(brassinolide,?BR)、乙烯(ethylene,?ETH)?含量的变化.结果表明:AMV和WCMV接种比例为3:1的植株720?h时的发病症状比单独接种一种病毒(AMV或WCMV)明显,主要症状表现为轻花叶、斑驳花叶、重花叶、明脉、皱缩.检测接种72?h时叶片病毒浓度发现,接种比例3:1的植株中AMV的浓度比单独接种AMV以及AMV和WCMV接种比例为1???1和1???3的处理高,而WCMV的浓度略低于其单独接种WCMV处理,高于AMV和WCMV接种比例为1???1和1???3的处理;接种AMV和WCMV混合液后复合侵染的本氏烟叶片中SA、JA、SLs、BR、ETH含量在一定时间内与单独接种AMV、WCMV及对照之间差异显著(P?相似文献   

苜蓿花叶病毒和白三叶草花叶病毒复合侵染对本氏烟中5种激素含量的影响

为探明苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)和白三叶草花叶病毒(white clover mosaic virus, WCMV)复合侵染的协生作用致病机理,以复合接种AMV+WCMV的本氏烟为处理,分别以单独接种AMV、WCMV、磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0, PBS)的本氏烟为对照,采用DAS-ELISA (double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay)方法检测了接种病毒72 h的本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片中的病毒含量及72～720 h内水杨酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)、独脚金内酯(strigolactones, SLs)、油菜素内酯(brassinolide, BR)、乙烯(ethylene, ETH) 含量的变化。结果表明：AMV和WCMV 接种比例为3∶1的植株720 h时的发病症状比单独接种一种病毒(AMV或WCMV)明显,主要症状表现为轻花叶、斑驳花叶、重花叶、明脉、皱缩。检测接种72 h时叶片病毒浓度发现,接种比例3∶1的植株中AMV的浓度比单独接种AMV以及AMV和WCMV接种比例为1 ? 1和1 ? 3的处理高,而WCMV的浓度略低于其单独接种WCMV处理,高于AMV和WCMV接种比例为1 ? 1和1 ? 3的处理;接种AMV和WCMV混合液后复合侵染的本氏烟叶片中SA、JA、SLs、BR、ETH含量在一定时间内与单独接种AMV、WCMV及对照之间差异显著(P < 0.05),其中,AMV和WCMV接种比例为3∶1的混合液可在一定时间段内提高本氏烟叶片中SA (216～504 h)、SLs (216～432 h)、BR (216～504 h)、ETH (288～720 h)含量,降低JA (216～504 h)含量,其SA、SLs、BR、ETH含量分别比单独接种AMV、WCMV和健康植株(CK)提高了36.27%以上,JA含量降低了59.09%多。     

基于小RNA深度测序技术的苜蓿病毒病鉴定与分析

紫花苜蓿是一种重要的牧草，然而紫花苜蓿病毒病的侵染严重影响其品质。本研究通过小RNA深度测序技术和RT-PCR/PCR的方法对采自山西农业大学植物园中表现花叶、皱缩、卷曲的紫花苜蓿样品进行病毒病原的鉴定，结果表明病样被苜蓿花叶病毒（AMV）、豌豆线条病毒（PeSV）、苜蓿矮化病毒（ADV）和苜蓿卷叶病毒（ALCV）4种病毒复合侵染。PCR扩增获得了ALCV山西太谷紫花苜蓿分离物SXTG(OP748371)的全基因组序列，分析表明该分离物与ALCV阿根廷紫花苜蓿分离物Colonia Dora(MG792026)的序列相似性最高，达到97.34%。对扩增获得的AMV CP基因（OP748369）核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行序列比对分析显示，AMV山西太谷紫花苜蓿分离物SX与阿根廷紫花苜蓿AMV分离物ACat(MW835977)相似性最高，核苷酸和氨基酸相似性分别为99.24%和99.54%。同样将扩增获得的ADVCP基因序列上传至GenBank获得登录号OP957285，命名为ADV山西太谷紫花苜蓿分离物（SXJZ），通过序列分析表明该分离物与ADV分离物N1(MZ221810)亲缘...     

不同症状类型苜蓿病毒病AMV病原检测及其寄主范围测定

为明确采自田间不同症状类型苜蓿病毒病病样中苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus,AMV)的带毒情况、症状表现与叶绿素含量的相关性及AMV的寄主范围，本试验通过田间调查采样、症状归类、丙酮乙醇混合液法和双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)法对不同病样的叶绿素和AMV含量进行测定和检测，并对提纯至不同症状类型病样中AMV对9科32种植物的致病性进行测定。结果表明田间苜蓿病毒病病样有轻花叶、重花叶、叶片边缘褪绿黄化型和叶片畸形皱缩花叶矮化型4种症状类型，均带有AMV，且叶绿素含量、AMV含量与症状表现之间具有正相关性，症状表现最严重的叶片畸形皱缩花叶矮化型病样的叶绿素a、b、总叶绿素含量均比对照低58.00%以上，类胡萝卜素含量比对照高134.06%,AMV含量最高，为252.96 pg·mL^-1；寄主范围测定表明AMV可侵染7科27种植物，对西葫芦致病性最强，症状表现为局部枯斑，30 d时AMV浓度为316.19 pg·mL^-1。     

苜蓿褐斑病抗性与几种同工酶的关系

以苜蓿5个品种在褐斑病抗性上存在差异的抗、感单株为材料，研究了接种病菌后苜蓿褐斑病抗性与多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)及其酶活性的关系。研究结果表明，褐斑病侵染后，苜蓿抗病株系和感病株系叶片中PPO、POD和SOD同工酶谱带多少和强弱存在明显的差异，即大部分抗病株系PPO、POD和SOD酶活性高于感病株系，并有新的同工酶带出现。PPO、POD和SOD在苜蓿抗褐斑病上可能起到重要作用，其同工酶谱带和酶活性的差异有可能做为鉴定苜蓿抗褐斑病的一种同工酶标记。     

表达AMV、WCMV外壳蛋白基因红三叶T1、T2代植株的分子生物学分析

随着生物技术的发展,转基因技术已经越来越多的应用到植物育种领域并发挥着重要的作用,将传统育种技术与转基因技术相结合,既可以缩短育种时间,并具有良好的经济效益.为最终获得能稳定遗传且性状优良的转基因植株,对其后代进行鉴定及筛选是非常重要的.本研究以抗苜蓿花叶病毒(AMV)转基因红三叶和抗白三叶花叶病毒(WCMV)的转基因红三叶人工杂交后代T1,T2代植株为研究对象,通过PCR及RT-PCR等分子生物学手段,对T1代34株植株进行PCR检测,筛选出12株阳性植株,其中兼有两种抗病基因的植株5株,各有一个抗病基因的植株7株,在这些植株中进行杂交组合,大部分杂交组合都结了种子,最终得到30株性状优良的T2代植株,对其进行PCR及RT-PCR检测,结果表明AMV与WCMV外壳蛋白基因能够在大部分T2代转基因植株中整合并表达,并且通过人工杂交,得到9株兼有两个抗病基因的杂交后代,外源基因稳定地从T0传至T2.同时也表明人工杂交是转基因植株基因累积的一种有效方法.     

豌豆蚜为害对苜蓿品种酶活性和营养物质的影响

为了探讨苜蓿(Medicago sativa)对蚜虫取食防御反应的生化机制,本研究通过室内人工接虫,研究了豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)取食后苜蓿体内防御性酶活性、营养物质含量的动态变化。结果表明,豌豆蚜为害7 d后,与低抗品种(惊喜、WL343HQ和德宝)相比,抗虫品种(三得利、MF4020、皇后、皇冠和SR4030)的苜蓿幼苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及可溶性糖活性变化总体上显著增高(P0.01),多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)活性变化显著降低(P0.01),中抗品种(柏拉图、甘农4号、先行者和中苜3号)介于其间,可溶性蛋白质含量变化量无明显规律。     

30个紫花苜蓿品种对苜蓿花叶病毒病的田间抗性初步研究

为了比较不同紫花苜蓿品种对病毒病的抗性,对30个紫花苜蓿品种的病毒病发病情况进行了田间调查,利用小RNA深度测序技术结合RT-PCR技术检测鉴定各紫花苜蓿品种中的病毒种类,并测定了各紫花苜蓿品种的发病率、病情指数、相对株高、相对单株干重、相对茎秆直径、相对叶面积、相对叶长和相对叶宽,综合比较各紫花苜蓿品种的抗性,并对部分指标进行系统聚类分析。结果表明:30个紫花苜蓿品种均只受到苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)的侵染,所有紫花苜蓿品种的田间发病率均超过94%,病情指数范围为31.53～55.50;30个紫花苜蓿品种中,抗性较强的品种有1个,为射手2号,抗性一般的品种有6个,其余23个品种的抗性较差,分别占供试品种的3.33%,20.00%和76.67%;聚类分析结果表明,抗性较强的射手2号与其他紫花苜蓿品种的亲缘关系较远,与其杂交有可能产生较大的杂种优势。     

AMV和WCMV在转基因红三叶中的基因累集

随着转基因技术的发展及其在植物育种中的应用，出现了一大批表现优良、经济效益高的转基因植物，但生产实践要求一种植物同时具有多个优良的转基因性状。目前解决这一问题的方法主要是基因累集(Gene pyramiding)，就是将多个基因集中到同一植株，可以将已经转入1个基因的植株做原材料，用农杆菌介导或基因枪等方法将另一基因转进去。也可以采用人工杂交，在不同转基因植株之间进行人工授粉，从后代中筛选出所需要的基因型。本研究对抗苜蓿花叶病毒(AMV)的转基因红三叶和抗白三叶花叶病毒(WCMV)的转基因红三叶进行了人工杂交，以期获得兼有2个基因、同时抵抗2种病毒的新植株，为下一步的育种打好基础。几乎所有的杂交组合都结了种子，杂交一代的发芽率随杂交亲本转基因拷贝数的不同而有所变化，只有1个转基因拷贝的亲本其杂种发芽率最高。对所有幼苗先用PCR进行检测，从中挑出较理想的基因型作进一步的分子生物学分析。Southern和Northern印迹分析结果表明，有些杂交一代的转入基因多于1个拷贝，有一部分同时兼有2种抗病基因，并且得到了表达。为进一步检测其抗病性，对它们进行了温室接种和田间评估，结果显示，尽管有的个体Northern分析呈阳性，但在田间仍然对病毒敏感，不过其感病程度都比对照有显著降低。大多数兼有2种转入基因的植株都能同时抵抗2种病毒，可以作为免疫个体供下一步育种之用。与遗传转化相比，人工杂交以其操作简单、省时省力、预见性强和准确率高而具有明显优势，是常规育种方法在分子育种中的具体体现。     

紫花苜蓿MsBBX24基因的克隆及耐盐性分析

盐胁迫是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因子之一，BBX家族转录因子在植物色素积累、光形态发生、种子生长发育以及逆境适应等方面具有重要的调节作用。为明确紫花苜蓿BBX基因的功能，本研究使用Primer Premier 5软件根据NCBI数据库MsBBX24基因的序列设计特异性引物，以紫花苜蓿的cDNA为模板克隆MsBBX24基因。利用生物信息学软件对基因序列和结构进行分析，并与其他植物的BBX24进行比对和进化树构建，分析它们之间的进化关系。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MsBBX24基因的表达模式。利用DNA的酶切与连接方法构建MsBBX24过表达载体，采用农杆菌介导法将其转入野生型拟南芥，通过除草剂Basta筛选，以半定量RT-PCR鉴定获得阳性转基因植株。通过对野生型和MsBBX24转基因拟南芥植株的表型观察和生理指标测定分析它们的耐盐性。研究结果表明，MsBBX24基因编码区序列长723 bp，编码240个氨基酸，分子量为30.58 kDa，等电点为7.74,MsBBX24与鹰嘴豆和蒺藜苜蓿的BBX24具有较高的同源性。qRT-PCR检测结果表明，MsBBX24基...     

全基因组水平紫花苜蓿TCP基因家族的鉴定及其在干旱胁迫下表达模式分析

紫花苜蓿是世界最重要的豆科牧草之一，干旱是影响其产量和地理分布的关键瓶颈。在紫花苜蓿响应干旱胁迫过程中，转录因子发挥着重要的调控作用。TCP（teosinte branchesd 1/cycloidea/pro-liferating cell factors）为植物特有的转录因子，在植物生长、发育、响应逆境胁迫中都具有重要的生物学功能。截至目前，该基因家族在紫花苜蓿中的分布以及响应干旱胁迫的生物学功能仍未见报道。因此，为进一步挖掘紫花苜蓿中响应干旱胁迫功能基因，本研究利用生物信息学方法在全基因组水平对TCP基因家族进行了鉴定，并对其系统进化、基因结构、染色体定位、共线性分析以及干旱胁迫下的表达模式进行了分析。结果表明，紫花苜蓿基因组中共鉴定出40个MsTCP基因，不均匀地分布于20条染色体上，其中包括17对旁系同源基因对，且都是基因片段复制事件。系统发育和保守结构域分析发现，MsTCP基因可以分为2个大分支和3个亚家族（PCF， CIN与CYC/TB1），同一分支中的成员具有相同氨基酸数目的TCP结构域，同亚家族中的成员具有相似的保守基序与基因结构。此外，通过分析紫花苜蓿响应干旱转录组数据共鉴定出4个可能与紫花苜蓿响应干旱胁迫有关的MsTCP基因（MsTCP23，MsTCP27，MsTCP29，MsTCP33）。qRT-PCR结果进一步表明PEG模拟干旱胁迫处理后，这4个基因的表达量在根和叶中均显著上调，进一步确定了这些基因的确响应紫花苜蓿干旱胁迫。该研究为后期深入解析紫花苜蓿响应干旱胁迫理论以及通过基因工程技术创制高抗旱紫花苜蓿新种质奠定基础。     

耐亚磷酸盐紫花苜蓿品种筛选及评价指标的鉴定

亚磷酸盐是正磷酸盐的一种还原形态,具有溶解度高、运输效率高、与土壤反应活性低等优势。通过探讨不同紫花苜蓿品种苗期对亚磷酸盐的耐逆能力,旨在为紫花苜蓿耐亚磷酸盐品种筛选和亚磷酸盐新型磷肥的开发提供科学依据。以37个紫花苜蓿品种为试验材料,设置正磷酸盐（0.5 mmol·L^-1 KH₂PO₄）和亚磷酸盐（0.5 mmol·L^-1 KH₂PO₃）两个处理,测定不同品种幼苗的株高（PH）、茎粗（SD）、茎叶磷含量（SPC）、茎叶干重（DWS）、根干重（DWR）、根冠比（RSR）、总根长（RL）、根表面积（RSA）、根磷含量（RPC）、叶绿素含量（Chl）、叶面积（LA）、净光合速率（P_n）12个形态和生理指标变化情况。以各单项指标的耐亚磷酸盐系数（PTC）作为衡量依据,运用主成分分析、隶属函数分析、聚类分析和逐步回归等方法对其耐亚磷酸盐的特性进行综合评价并建立数学模型。在亚磷酸盐胁迫下,不同紫花苜蓿品种根磷含量和叶绿素含量增加,其余指标均显示下降。通过主成分分析,可将12个单项指标转换成5个相互独立的综合指标,根据耐亚磷酸盐综合评价值和聚类分析,可将37个品种划分为4个类别,其中,高度耐亚磷酸盐包括WL903和可汗2个,中度耐亚磷酸盐12个,低耐亚磷酸盐17个,亚磷酸盐敏感型6个。进一步利用逐步回归方法建立了耐亚磷酸盐特性的评价回归模型Y=-0.174+0.102PH+0.189DWR+0.168 RL+0.187RSA-0.061P_n （R²=0.9908）,且各品种对回归方程的估计精度均大于93.22%。综合表明：高度耐亚磷酸盐的品种有可汗和WL903;在亚磷酸盐胁迫下,株高、根干重、总根长、根表面积和净光合速率等可作为紫花苜蓿品种耐亚磷酸盐特性强弱的快速鉴定和预测指标。     

44个紫花苜蓿品种的酸铝适应性与耐受性评价

为了解紫花苜蓿在贵州地区的适应性及耐酸铝胁迫机理，以44份紫花苜蓿品种为研究对象，研究紫花苜蓿处于酸铝胁迫下的生理变化，并揭示其生理变化与耐酸铝胁迫间的关系。利用基因与环境互作模型对两个地点1年的紫花苜蓿进行产量分析，筛选出阿尔冈金、新疆大叶苜蓿、Trifecta、Vernal和中牧1号苜蓿5个耐酸铝强适应品种。利用敏感型UC-1465和耐受型阿尔冈金进行酸铝胁迫试验。结果表明：相同处理下，耐受型紫花苜蓿的电导率、相对铝含量、死亡率显著低于敏感型；紫花苜蓿对酸铝胁迫的响应主要通过柠檬酸、苹果酸、乙酸、酒石酸、反丁烯二酸和草酸的显著（P<0.05）增加来体现，其中苹果酸的合成和分泌增多可能是其耐酸铝胁迫的重要原因。     

根系分隔方式下紫花苜蓿/燕麦间作氮素利用及种间互馈特征研究

为探明紫花苜蓿/燕麦间作下种间氮营养竞争和互馈，试验采用桶栽土培法对紫花苜蓿和燕麦进行模拟间作，通过不同生育期、不同氮素水平及不同根系分隔方式对紫花苜蓿和燕麦的氮代谢特性、根系特性及紫花苜蓿结瘤特性进行研究。结果表明：燕麦氮代谢特性、根系特性及紫花苜蓿结瘤特性在各生育期和氮素水平下表现为不分隔>尼龙网分隔>塑料分隔≥单作，且差异显著。紫花苜蓿的氮代谢酶活性、氮含量、氮积累量在现蕾期和初花期时均表现为单作显著大于不分隔和尼龙网分隔（P<0.05），根系平均直径和根系体积在各生育期和氮素水平下表现为单作>塑料分隔>尼龙网分隔>不分隔，且单作显著大于不分隔。在两个氮素水平下，各生育期的紫花苜蓿和燕麦的氮代谢酶活性、干物质重、氮含量、氮积累量、根表面积、根平均直径、根体积、根系活力均表现为N₂₁₀（施氮水平）>N₂₁（不施氮水平），而紫花苜蓿总根瘤重、总根瘤数、有效根瘤数、有效/根瘤数均表现为N₂₁₀21，且在初花期时不同根系分隔方式间的差距最大。因此，在紫花苜蓿/燕麦间作体系中，种间根系互作越紧密，越有利于燕麦根系的生长和根系活力的提高，增强燕麦氮同化能力，促进紫花苜蓿结瘤固氮并将由此产生的氮素部分继续转移给燕麦，增强间作系统中种间氮营养的互补利用，以达到紫花苜蓿/燕麦间作体系内的种间氮营养高效回馈，从而有效提高了间作体系中氮素的利用效率；且适宜氮素的添加和生育期的推进，使得种间根系互作不断加强，加强了种间氮素的互补利用，促进其间作体系内氮素的高效利用。     

水分和添加剂对苜蓿青贮效果的影响

为研究苜蓿的水分、添加剂对苜蓿青贮发酵品质的影响,通过对头茬苜蓿设置3个水分梯度,并添加4个水平的甲酸、丙酸、双乙酸钠,装入聚乙烯袋抽真空,发酵45 d 后进行营养分析和品质鉴定。结果表明：适宜苜蓿青贮的水分条件为55%,这一水分条件下苜蓿青贮料的 pH、氨态氮、粗纤维最低,可溶性糖、乳酸最高;而3种添加剂对青贮料的影响具体表现为：与对照组相比,能够显著降低苜蓿青贮料的 pH 和氨态氮含量（P 〈0.05）,并且能够很好地保存青贮料中的可溶性糖,通过对灰色关联度分析,甲酸对苜蓿青贮的影响效果最佳,丙酸次之;且55%的水分条件下添加15 mL/kg 的甲酸,青贮效果为最好。