牛源无乳链球菌分离及其诱导的乳房炎小鼠模型构建

研究旨在分离并鉴定致病性无乳链球菌并构建小鼠乳房炎模型。试验从病牛乳汁中成功分离并鉴定1株无乳链球菌(命名为HZ-032)。HZ-032以10~4CFU菌量感染哺乳期小鼠,同时设相同剂量无乳链球菌ATCC 13813菌悬液组、阴性对照(等体积无菌PBS)组及空白组作为对照,观察攻毒后小鼠乳腺组织病变并进行组织细菌载量的测定;制作乳腺组织石蜡切片,经HE染色镜下观察组织病理变化;采用荧光定量PCR测定乳腺组织中IL-1α、IL-6、IL-10、TNF-α4种炎性因子相对表达量。结果表明,感染组小鼠乳腺组织可分离出大量HZ-032菌株;组织病理切片显示,感染后小鼠乳腺组织较阴性对照和空白组明显观察到乳腺上皮细胞溶解,腺泡内有大量中性粒细胞浸润;荧光定量PCR结果显示ATCC 13813和HZ-032处理组中IL-1α、IL-10、TNF-α表达量均显著升高(P0.05),IL-6在HZ-032处理组显著升高(P0.05)。本研究从患病奶牛乳样中分离1株致病性无乳链球菌HZ-032,并使用该菌成功构建小鼠乳房炎模型,为进一步研究无乳链球菌致乳房炎的相关致病机制及防治措施奠定了基础。     

禽巴氏杆菌环丙沙星耐药株转录组测序与分析

为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(Avian Pasteurella multocida,Pm)敏感株与环丙沙星(Cip)耐药株的差异表达基因,本研究采用高通量转录组测序的RNA-seq技术对敏感株与Cip耐药株进行检测,参考Pm70株基因组(NC_002663.1)进行拼接与质量评估,测序数据处理后获得表达差异基因,利用GO和KEGG数据库对表达差异基因进行注释与富集性分析,并利用荧光定量PCR对转录组测序中的差异表达基因进行验证。结果显示,所有样品测序数据参考Pm70全基因组匹配率均达到95.87%以上,对基因差异表达进行分析后鉴定得到19个差异表达基因,其中15个上调,4个下调。通过GO功能富集分析显示差异表达基因主要为转运运输功能,并对差异表达基因进行信号通路富集性分析,结果表明最具代表性的信号通路为"ABC转运蛋白"(ko02010)。推测禽源Pm中的ABC转运蛋白超家族可能在Cip耐药机制中具有重要作用。     

禽巴氏杆菌四环素耐药株转录组测序与分析

为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(avian Pasteurella multocida,Pm)四环素(Tetracycline,Tet)敏感株与耐药株(MIC=32μg/mL)在转录组水平上的差异,本研究采用RNA-seq技术对Tet敏感株与耐药株进行双向测序,通过GO、KEGG和ARDB数据库对表达差异基因进行注释和富集性分析。结果显示,共筛选出442个差异表达基因,其中包括103个上调基因和339个下调基因。通过GO功能富集分析显示差异表达基因多数富集于核糖体结构成分、rRNA结合、跨膜运输和离子转运等生物过程;对差异表达基因进行信号通路富集性分析,大多数差异表达基因分布在ABC转运蛋白与核糖体代谢途径中;对差异表达基因进行耐药基因注释(ARDB),发现其中的耐药基因主要为核糖体保护蛋白和外排系统两类。本研究表明禽源Pm对四环素耐药的耐药机制可能与细胞膜上ABC转运蛋白的过量表达以及核糖体保护蛋白有关。     

梅花鹿致敏与休眠鹿茸干细胞差异蛋白表达的2D-DIGE分析

旨在对梅花鹿(Cervus nippon)致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞表达蛋白进行差异筛选、鉴定及生物信息分析,为深入探讨鹿茸独特的再生分子调节机制奠定基础。本研究采用双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2D-DIGE)分离蛋白样品;利用DeCyder 7.2分析软件对2D-DIGE图像进行统计学分析寻找差异表达蛋白;利用MALDI-TOF-MS(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry)鉴定差异蛋白,通过Mascot软件搜索NCBInr数据库寻找匹配的蛋白;采用PANTHER(Protein Analysis Through Evolutionary Relationships)软件对差异蛋白进行聚类分析,REACTOME数据库分析差异蛋白所参与的信号通路。结果得到了致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞2D-DIGE图谱,致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白丰度相比较,比值≥1.1倍以及比值≤-1.1倍(P0.05)的差异蛋白点有159个,其中110个上调表达,49个下调表达,EDA(Extended data analysis)分析得到了多个Marker蛋白,质谱鉴定了84个差异蛋白质点,48个为阳性结果,共来自27种蛋白质。并对已鉴定蛋白进行了GO分析以及信号通路富集分析。致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白差异明显,质谱鉴定获得了来自多种可能与鹿茸再生相关的差异蛋白。由此可知,鹿茸再生是鹿茸干细胞从休眠到致敏的转化过程,需要多种蛋白分子以及信号通路的综合调控。     

禽巴氏杆菌链霉素耐药株转录组测序与分析

为鉴定禽源多杀性巴氏杆菌(Pm)链霉素(Str)敏感株与耐药株(MIC=1024μg/mL)在转录组水平上的差异,本研究采用RNA-seq技术对Str敏感株与耐药株进行双向测序,筛选得到差异表达基因,通过GO、KEGG和ARDB数据库对差异表达基因进行分组和富集性分析,并利用荧光定量PCR对筛选出的差异表达基因进行验证。结果显示,共筛选获得625个差异表达基因,其中包括581个上调基因和44个下调基因。通过GO功能富集分析显示差异表达基因多数发挥细胞膜转运功能;对差异表达基因进行信号通路富集性分析显示,大多数差异表达基因分布在ABC转运蛋白与双组分系统代谢途径中;采用ARDB对差异表达基因进行耐药基因分析,显示其中的耐药基因主要为氨基糖苷转移酶类和外排系统两类。本研究结果表明,禽源Pm对Str的耐药机制可能与细胞膜上多药外排泵的过量表达和氨基糖苷转移酶类灭活抗菌药物有关。同时,也为进一步研究禽源Pm对Str的耐药机制奠定了基础。     

山东不同地区乳房炎和非乳房炎牛奶中主要病原菌的调查

通过对13个地区35个牧场的985份非乳房炎奶样和284份乳房炎奶样进行常见病原菌分离鉴定,以期了解山东地区牛奶中主要病原菌的流行情况。采用常规方法与生化鉴定、PCR技术对样品进行细菌分离鉴定,利用系统进化群试验对大肠杆菌致病性进行分析。结果显示:(1)获得金黄色葡萄球菌150株(11.82%),大肠杆菌248株(19.54%),无乳链球菌35株(2.76%),停乳链球菌18株(1.42%),乳房链球菌49株(3.86%);乳房炎样品细菌检出率(51.41%)明显高于非乳房炎样品(35.94%)(P<0.01);(2)青岛地区样品检出率(67.91%),高于其他地区(P<0.05),金黄色葡萄球菌在青岛检出率(50.0%)最高,大肠杆菌在东营的检出率(40.0%)最高;乳房链球菌在日照的检出率(31.25%)最高,无乳链球菌和停乳链球菌在各地的检出率无明显差异;(3)6月份样品中细菌检出率(67.91%)最高,且明显高于其他采样时间(P<0.01);(4)248株大肠杆菌中,共生群A群213株(85.89%),致病群35株(14.11%),乳房炎样品致病群检出率(22.39%);明显高于非乳房炎样品(11.05%)(P=0.023)。表明山东省牛奶中主要致病菌为金黄色葡萄球菌,乳房炎样品细菌和致病群检出率均高于非乳房炎样品,不同地区致病菌检出率存在差异,且夏季最高,秋冬季节低。     

抗菌肽NZ2114对来源于奶牛乳房炎的无乳链球菌及其生物膜的消杀作用

为探究抗菌肽NZ2114对无乳链球菌的体外抑制效果和相关机制,本试验以无乳链球菌ATCC 13813为研究对象,通过最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)、杀菌动力学、抗生素后效应和电镜学试验对抗菌肽NZ2114杀菌特性和杀菌机制进行评价,并进一步分析其对无乳链球菌生物膜和持留菌的抑制和消除作用。结果显示,NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813的MIC为0.23μmol/L,对3株奶牛乳腺炎临床分离菌株CAU-FRI 1、2和3的MIC均为0.11μmol/L,万古霉素对以上4株受试菌株的MIC值均为0.67μmol/L,因此NZ2114的抗菌活性是万古霉素的2.91和6.09倍。同时,2×MIC、4×MIC浓度的NZ2114可在0.5 h内杀灭99.9%细菌,且持续药效作用可达270 min。扫描电镜结果显示,NZ2114处理后,细菌表面出现皱缩甚至破裂,细菌产生的生物膜消除。NZ2114在2×MIC下,24 h对早期生物膜抑制率为99.9%;在32×MIC下,24 h对成熟生物膜消除率达99.9%。此外,NZ2114在16×MIC时,对生物膜内的菌体具有99.9%以上的杀灭效果;万古霉素无法清除的持留菌经0.5×MIC的NZ2114处理后,也可以达到99%以上的消除率。激光共聚焦结果显示,NZ2114处理后的生物膜厚度从28.48μm减少到10.32μm,证明了其强效杀菌和抑制生物膜的作用。上述结果表明,NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813杀菌活性高、速度快、抑制/去除生物膜能力强,并对膜内菌及持留菌具有高效杀菌作用,且作用显著高于万古霉素。因此,NZ2114具有开发成为治疗由无乳链球菌引起的奶牛乳房炎新型制剂的潜力。     

布鲁氏菌野毒株A544与疫苗株104M的差异蛋白筛选

为给布鲁氏菌病自然感染与疫苗免疫鉴别方法的建立提供参考,采用比较蛋白质组学研究技术,以野毒株A544和疫苗株104M的菌体蛋白为研究对象,以双向电泳技术为分离手段,以基质辅助激光解吸飞行时间质谱为检测手段,利用生物学信息解析所得实验结果。双向电泳结果分析显示,野毒株A544和疫苗株104M之间约有20个差异蛋白点,经质谱成功鉴定了9种蛋白。通过蛋白数据库检索发现,这些蛋白主要参与了一些代谢调节等生物过程,其中有6个蛋白点在野毒株A544上高表达,3个蛋白点在疫苗株104M上高表达。     

Ⅰa型牛源无乳链球菌LZQ07006分离株BibA基因片段的分子特征分析

试验旨在对Ⅰa型牛源无乳链球菌BibA基因及其编码的蛋白进行分子特征分析,为进一步研究BibA蛋白的表达及免疫原性提供理论依据。采用PCR技术扩增牛源无乳链球菌LZQ07006分离株BibA基因片段,并将其克隆入pMD20-T载体后测序,采用生物学软件对BibA基因及其推导的蛋白进行生物信息学分析。结果显示,LZQ07006菌株BibA基因片段长度为1185 bp,未出现基因缺失,编码395个氨基酸,与GenBank中已发表的不同血清型的无乳链球菌核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为45.0%～99.8%和12.3%～99.5%;BibA基因片段是一个稳定的分泌性外膜蛋白,亲水性较好,存在1-32位氨基酸的信号肽,剪切位点在第32-33位氨基酸之间的蛋白片段上。因此,牛源无乳链球菌BibA蛋白可作为奶牛乳房炎诊断和预防的应用性候选蛋白,但需深入研究。     

鸡源鸭疫里默杆菌的分离鉴定及ompA基因遗传进化分析

从病死鸡肝脏中分离到8株革兰阴性多形杆菌,对8株分离株进行形态学和16S rDNA基因鉴定并分析ompA基因及其推导的蛋白序列遗传进化特征。16S rDNA进化分析显示,8株鸡源分离株与22株鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)参考株形成一个大的进化分支,与RA模式菌株ATCC11845和22株RA参考株之间的同源性分别为99.3%~99.8%和98.8%~100.0%。根据形态学和16S rDNA基因鉴定结果,将8株分离株鉴定为RA。ompA基因进化分析显示,8株鸡源RA分离株与3株鸭源RA分离株KML1、KML2、KML3以及1株鹅源RA分离株KS9901-G形成一个大的进化分支,同源性为94.0%~99.6%。与ATCC11845株相比较,8株鸡源RA分离株ompA基因均发生99个核苷酸位点的突变。OmpA蛋白进化分析显示,8株鸡源RA分离株形成一个独立的大的进化分支,同源性为100%。与ATCC11845株相比较,8株鸡源RA分离株OmpA蛋白均发生19个氨基酸位点的突变。8株鸡源RA分离株对青霉素、阿莫西林克拉维酸、头孢噻吩等10种抗生物敏感。本试验在国内分离到鸡源RA,证实鸡RA感染在我国的存在,对鸡RA感染的预防和控制具有重要指导意义。     

抗菌肽NZ2114对来源于奶牛乳房炎的无乳链球菌及其生物膜的消杀作用

为探究抗菌肽NZ2114对无乳链球菌的体外抑制效果和相关机制,本试验以无乳链球菌ATCC 13813为研究对象,通过最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）、杀菌动力学、抗生素后效应和电镜学试验对抗菌肽NZ2114杀菌特性和杀菌机制进行评价,并进一步分析其对无乳链球菌生物膜和持留菌的抑制和消除作用。结果显示,NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813的MIC为0.23 μmol/L,对3株奶牛乳腺炎临床分离菌株CAU-FRI 1、2和3的MIC均为0.11 μmol/L,万古霉素对以上4株受试菌株的MIC值均为0.67 μmol/L,因此NZ2114的抗菌活性是万古霉素的2.91和6.09倍。同时,2×MIC、4×MIC浓度的NZ2114可在0.5 h内杀灭99.9%细菌,且持续药效作用可达270 min。扫描电镜结果显示,NZ2114处理后,细菌表面出现皱缩甚至破裂,细菌产生的生物膜消除。NZ2114在2×MIC下,24 h对早期生物膜抑制率为99.9%;在32×MIC下,24 h对成熟生物膜消除率达99.9%。此外,NZ2114在16×MIC时,对生物膜内的菌体具有99.9%以上的杀灭效果;万古霉素无法清除的持留菌经0.5×MIC的NZ2114处理后,也可以达到99%以上的消除率。激光共聚焦结果显示,NZ2114处理后的生物膜厚度从28.48 μm减少到10.32 μm,证明了其强效杀菌和抑制生物膜的作用。上述结果表明,NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813杀菌活性高、速度快、抑制/去除生物膜能力强,并对膜内菌及持留菌具有高效杀菌作用,且作用显著高于万古霉素。因此,NZ2114具有开发成为治疗由无乳链球菌引起的奶牛乳房炎新型制剂的潜力。     

奶牛乳房炎无乳链球菌的分离及PCR鉴定

利用THB(Todd-Hewitt Broth)固体培养基和色素试验培养基选择培养无乳链球菌,参照GenBank中无乳链球菌参考菌株(Accession:AF015927.1、JQ289582.1)16SrRNA和种属特异性基因cfb(CAMP因子)序列设计引物,对奶样中分离的12株疑似无乳链球菌进行鉴定。结果显示,经PCR扩增后,被检测的12株细菌均可扩增出预期大小的16S rRNA基因序列,而12株中有8株可以扩增出预期大小的cfb基因序列,条带单一,特异性好。序列BLAST显示,12株菌的16S rRNA基因序列与NCBI上报道的无乳链球菌相应序列高度同源(>99.0%),各分离菌株间的16S rRNA基因序列也高度同源(99.0%～100.0%);cfb基因序列与NCBI上已报道的无乳链球菌相应序列具有高度同源性(>99.0%),各菌株间cfb基因序列也高度同源(100.0%)。经选择培养与PCR鉴定结果可以确定12株疑似菌株中有8株为无乳链球菌。     

裸花紫珠颗粒对罗非鱼源无乳链球菌体外抑菌活性研究

无乳链球菌是导致罗非鱼链球菌病的主要病原菌。为探讨裸花紫珠颗粒对无乳链球菌体外抑菌活性，采用肉汤二倍稀释法测定裸花紫珠颗粒对无乳链球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),同时进行标准无乳链球菌和临床分离无乳链球菌对常用抗菌药的敏感性试验。结果表明，裸花紫珠颗粒对罗非鱼源无乳链球菌的最低抑菌浓度(MIC)为10.000 mg/mL,最小杀菌浓度(MBC)为20.000 mg/mL;药敏试验结果显示临床分离株无乳链球菌对四环素、环丙沙星、氟苯尼考的敏感性降低。该结果为下一步开展裸花紫珠对罗非鱼临床保护试验研究奠定了基础。     

我国西北地区奶牛源乳房炎无乳链球菌的青霉素耐药特性研究

为了研究我国西北地区分离的奶牛源乳房炎无乳链球菌的青霉素耐药特性,试验采用药敏纸片法检测82株无乳链球菌对青霉素的耐药性,利用β-内酰胺酶试剂盒测定耐青霉素菌株β-内酰胺酶活性,通过刚果红法定性检测生物被膜的形成能力。结果表明:在82株受试无乳链球菌中,对青霉素耐药的菌株有18株(21.95%),β-内酰胺酶为阳性的有11株(13.41%),生物被膜为阳性的有64株(78.05%);在18株青霉素耐药菌株中,β-内酰胺酶为阳性的有9株(50.00%),生物被膜为阳性的有17株(94.44%),β-内酰胺酶和生物被膜同为阳性的有8株(44.44%);β-内酰胺酶为阳性而生物被膜为阴性的菌株有1株(5.56%),β-内酰胺酶为阴性但生物被膜为阳性的菌株有9株(50.00%)。说明奶牛乳房炎无乳链球菌对青霉素的耐药率较高,无乳链球菌青霉素耐药性受β-内酰胺酶和生物被膜等多种因子共同调控。     

停乳链球菌内蒙分离株抗原基因MIG的克隆

停乳链球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌,根据GenBank中登陆的停乳链球菌表面蛋白MIG基因序列,设计一对引物,采用PCR的方法从临床分离的停乳链球菌内蒙分离株基因组DNA中扩增出MIG基因,得到一条1900bp的片段。将其连入PMD-19T载体中,经酶切,PCR及序列测定法进行鉴定。经DNA测序分析,证实与GenBank中停乳链球菌MIG基因(AF354651)序列同源性为95%,具有高度保守性。     

猪源链球菌的分离与鉴定

从浙江地区98例发病样品猪猪体共分离到56(57％)株猪源链球菌，对12株典型分离株进行培养特性、生化特性及血清型的鉴定，多数具α或β溶血，其中C群链球菌8株。L群链球菌1株，2型猪链球菌2株。未定群1株。小鼠对12株分离株的敏感性有一定的差异。结果表明：浙江地区分离到的猪链球菌已不是单一的C群链球菌，且C群中也不是以往的马链球菌兽疫链球菌亚种。而是停乳链球菌似马亚种。并首次分离到猪链球菌2型。     

昆明地区猪源链球菌分离株血清群检测及致病病型分析

从昆明地区可疑病料中分离出12株猪源致病性链球菌,对其进行了血清群鉴定。结果表明分离菌株中以兰氏D群为主,其次为C群。其中D群4株(33.3%),C群3株(25%),A群1株(8.3%),E群1株(占8.3%),未能定群3株(25%)。分离株cg1为猪链球菌2型。通过对临床病例血清型检测显示,猪链球菌病在昆明地区广泛存在,尤以寒冷季节多发,主要病型包括败血型、脑膜炎型和关节炎型。     

盐酸克林霉素对奶牛急性乳房炎病的疗效试验

对奶牛急性乳腺炎病原菌进行了分离和鉴定,鉴定出致病菌是金黄色葡萄球菌和B群无乳链球菌.用平皿二倍稀释法测定了克林霉素等12种药物对临床分离的16株金黄色葡萄球菌和10株无乳链球菌的MIC.结果显示,金黄色葡萄球菌和无乳链球菌对克林霉素敏感.临床疗效试验结果表明,克林霉素组的治愈率与感染对照组比较差异极显著(P＜0.01),克林霉素组治愈率、有效率与其它对照组比较差异显著(P＜0.05),表明克林霉素对奶牛乳腺炎病的治疗有很好的疗效.     

海南罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及生物学特性研究

为探究目前海南地区罗非鱼无乳链球菌病的流行性,了解该地区无乳链球菌耐药情况,本研究2020年8月从海南地区部分渔业养殖场的病鱼中共分离获得15株无乳链球菌,对各分离菌株的血清型、主要毒力基因及耐药性进行检测,并对多重耐药情况进行分析。血清型检测结果显示,15株分离菌株的血清型与对照菌株A909一致,均为Ⅰa型。毒力基因检测结果显示,15株分离菌株均未检出毒力基因scpB,但该毒力基因在参考菌株人源无乳链球菌2603V/R中检出,而主要毒力基因cylE、sodA、gapC的检出率均为100%。药敏试验结果表明,15株分离菌株对甲氧胺嘧啶、磺胺异噁唑、复方新诺明、链霉素、新霉素、庆大霉素的耐药率达85%以上;对头孢克洛、头孢曲松、头孢哌酮、头孢拉定、卡那霉素、红霉素、利福平、克林霉素敏感性达80%以上;未发现对甲氧胺嘧啶、氟罗沙星、链霉素、新霉素、庆大霉素敏感的菌株。多重耐药检测结果表明,15株分离菌株均至少对4种药物表现耐药,其中6重及以上耐药的菌株占总分离菌株数的86.67%,并有2株为13重耐药菌株。本研究为海南地区鱼源无乳链球菌病的用药提供参考,为华南地区罗非鱼无乳链球菌的流行病学和疾病防控提供调查依据。     

获能前后绵羊精子的差异蛋白质组学分析

为了探索获能前后绵羊精子蛋白质的动态变化，通过串联质谱标签结合液质联用分析技术，对获能前后绵羊精子的总蛋白进行定量分析。结果显示：获能前后绵羊精子的差异表达蛋白共有203个，获能后表达上调蛋白质27个，表达下调蛋白质176个。差异表达参与解剖结构发育、生殖等生物学进程；从细胞组分看，差异表达蛋白定位在细胞溶质、质膜中；从分子功能看，主要参与氧化还原等过程。差异表达蛋白也参与蛋白酶体、Hedgehog和cAMP等信号通路。通过差异蛋白表达结合文献分析，筛选出乳铁蛋白。Western blot结果表明，乳铁蛋白在绵羊精子中存在，且在获能后表达量极显著降低(P<0.000 1);RT-qPCR结果表明，乳铁蛋白在获能前后绵羊精子中均存在，且差异极显著(P<0.001),说明乳铁蛋白对绵羊精子获能有一定的影响。