一株鸭源新城疫病毒毒力基因分析及其对鸭的致病性研究

为了解中国鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的毒力特点,从2009年广东地区发病鸭群中分离和鉴定出1株新城疫病毒(简称NDV-104),对其生物学特性、致病性和融合蛋白(fusion,F)、血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因进行了研究。结果显示,分离株的MDT、ICPI和IVPI分别为56.4 h、1.95和1.64,结合F蛋白裂解位点(112~117位)的氨基酸序列分析,确定了分离株为新城疫强毒。致病性结果表明,分离病毒对雏鸭具有感染性和致病性。F基因遗传进化结果显示,分离株属于基因Ⅶd亚型。F、HN蛋白的氨基酸同源性结果表明,分离株与2000年以来国内外分离到的基因Ⅶ型NDV同源性较高,分别为96.6%~99.3%和97.0%~99.7%,而其与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和LaSota的F、HN蛋白氨基酸序列的同源性较低,且与LaSota株和V4株的同源性最低,分别仅为88.1%和87.6%,说明分离株与经典新城疫病毒毒株存在一定的差异。     

1株鸡新城疫强毒株的分离鉴定及致病性

从山东省一发病率、死亡率高的肉鸡群中分离到1株病毒,经HA、HI试验和动物回归试验确定所分离的毒株为新城疫病毒,命名为新城疫LVCX株。按常规方法测得LVCX株的MDT、ICPI和IVPI分别为47.4h、1.975和2.85,鸡胚半数致死量LD50为10-9.8。F基因分析表明分离株LVCX为基因Ⅶ型,其多肽裂解位点为112-RRQKRF-117,表明LVCX株为新城疫病毒强毒株。该毒株F基因核苷酸同源性与近几年分离的基因Ⅶ型鸡源毒株同源性在93.5%～98.3%之间;与经典强毒株F48E9和Lasota株的核苷酸和氨基酸同源性分别为85.8%、91.3%和83.3%、88.4%;且与近几年分离的几株鹅源、鸭源核苷酸同源性也较高,在95.2%～96.5%之间。     

贵州省鸭源新城疫病毒强毒株的遗传变异分析及致病性研究

为了科学理解家鸭在新城疫病毒(NDV)流行和传播中的作用,对贵州不同地区分离的5株鸭源NDV强毒株进行遗传变异分析以及对鸭和SPF鸡的致病性研究。结果显示:5株NDV分离株均属于基因Ⅶd亚型,其F蛋白裂解位点基序均为112 RRQKRF117,符合强毒株序列特征,与病毒致病性指数测定结果相符;F和HN蛋白中功能性氨基酸位点均高度保守,但在HN蛋白线性表位区有3株发生E347K突变。交叉血凝抑制试验发现分离株与传统疫苗株LaSota的抗原同源性较低(为83.3%~87.0%),而与新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性较高(为93.5%~100%)。将5株NDV分离株以0.5mL病毒尿囊液原液通过肌肉注射感染鸭后未见明显发病死亡和病理变化,并且除脾外在其他多个组织脏器未能检测到病毒复制;而以106.0 ELD50·0.1mL-1剂量通过滴鼻点眼感染SPF鸡后6d内100%发病死亡,病死鸡表现出新城疫典型的临床症状和病理变化,病毒在多个组织脏器中均能复制且对脾、胸腺和法氏囊等免疫器官损伤严重。另外,SPF鸡攻毒后喉头和泄殖腔棉拭病毒分离率明显高于试验鸭。本研究结果表明,贵州省鸭群中流行的基因Ⅶd亚型NDV强毒株HN蛋白发生E347K突变的变异株呈上升趋势,并与传统疫苗株产生抗原差异;5株鸭源NDV强毒株对鸭和鸡致病性差异显著,虽然对鸭无明显致病性,但鸭感染后可在较长时间内通过喉头或泄殖腔向体外排毒,因此必须采取有效措施防止NDV强毒由鸭群向鸡群的传播。     

12个新城疫病毒分离株的F基因和HN基因序列分析

自1997年-2016年从广东佛山、肇庆、云浮等地疑似新城疫的家禽病料分离鉴定获得12株新城疫病毒,采用RT-PCR方法对所有分离株的F基因和HN基因进行扩增,产物经克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株做遗传进化分析。12个分离株的F基因遗传进化分析结果显示,9株属于基因Ⅶ型,2株属于基因Ⅸ型,1株属于基因Ⅵ型。F基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在81.6%~91.5%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84.8%~99%之间;HN基因同源性分析结果显示,12个毒株与目前疫苗株La Sota、B1、Mukteswar和Clone30的同源性在80.9%~91.9%之间,12个毒株间同源性的差异较大,9个Ⅶ型分离株之间的同源性在84%~98.5%之间。氨基酸序列分析表明,12个分离株与NDV强毒株的氨基酸特征相符,有10个分离株的HN基因第514氨基酸残基出现Ⅰ→Ⅴ的变异,有9个分离株的F基因和HN基因的中和抗原位点出现变异。试验提示,当前广东部分地区的分离株与传统疫苗株之间存在抗原性差异,故应加强广东地区新城疫病毒的分子遗传监控。     

广东地区8株鹅源基因Ⅻ型新城疫病毒F蛋白基因遗传进化分析

为了解当前广东地区鹅群新城疫病毒(NDV)遗传进化情况,本研究从广东养殖病死鹅组织样品中分离鉴定获得8株NDV,对分离株的F蛋白基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。8株分离病毒之间F蛋白基因同源性较高,为96.3%-99.9%,但与当前国内NDV优势流行株及疫苗株同源性均较低。遗传进化分析结果显示所有新分离株均属于Ⅻ型NDVⅫb亚型分支,而当前国内NDV的优势流行株及常用疫苗株均属于Ⅶd亚型分支。氨基酸序列分析结果显示,本研究分离株F蛋白裂解位点氨基酸序列均为~(112)K/RRQKR/F~(117),符合强毒株分子特征;与基因Ⅶ型代表株NDV/ZJ1相比,新分离株F蛋白B细胞中和抗原表位均出现D~(170)N变异;而与2010年～2011年报道的广东Ⅻb亚型分离株相比,新分离株F蛋白疏水区、七肽重复序列等区域均出现氨基酸的变异。综上所述,本研究分离鉴定的8株鹅源NDV的F基因均属于Ⅻb亚型,与Ⅶd亚型流行株及常用疫苗株F基因同源性较低,且其多个氨基酸关键位点存在变异。本研究在国内首次从病死鹅体内分离到基因Ⅻ型NDV,为进一步了解基因Ⅻ型NDV在广东地区水禽中的流行、病原进化以及疫苗株更新提供参考。     

野鸭源新城疫病毒的分离及其F基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法扩增从野鸭体内分离到的3株新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)(JS-1/06/wd、JS-2/06/wd和JS-3/06/wd)F基因,并对其序列进行了测定和分析。结果表明该分离株的F基因长1 662 bp,编码553个氨基酸;F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K/R-R-F117,符合NDV强毒株的特征。这些毒株间核苷酸同源性为99.8%~99.9%,与鹅源NDV QY971株和ZJ1株的核苷酸同源性也高达96.7%~97.5%;氨基酸同源性为96.8%~97.5%;而与我国标准强毒株F48E9及疫苗株LaSota的核苷酸同源性分别为86.9%和84.5%;氨基酸同源性分别为94.5%和87.0%。系统发育树分析结果表明,野鸭源NDV与鹅源NDV的遗传关系较近,同属于基因Ⅶ型。     

产蛋下降鸭群强毒新城疫病毒的分离鉴定与分子特征

从产蛋下降鸭群分离到两株新城疫病毒(NDV)(命名为Duck/China/SD6/2008和Duck/China/SD7/2009),经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间为77.6h,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-RRQKRF-117,符合强毒NDV的特征。根据F基因(374bp)对2个NDV分离株和30个NDV参考株进行基因分型结果表明,2个分离株均属于基因Ⅶ型。F基因和HN基因核苷酸序列同源性比较显示,2个鸭分离株与基因Ⅶ型NDV分离株同源性为94.1%～99.7%和94.4%～97.1%,与同期分离的鸡源NDV强毒株Chicken/China/SD4/2008同源性最高,分别为99.3%～99.5%和99.5%～99.7%,表明这两个鸭NDV毒株可能来源于感染NDV的鸡群。     

两株鸽源新城疫病毒的分离鉴定及F基因序列分析

从四川省两个不同肉鸽养殖场的送检病鸽中分别分离出2株鸽源新城疫病毒(NDV),分别命名为Mianyang12505和sms12。致病性试验表明2株鸽源NDV均为弱毒,但融合蛋白(F)基因序列分析表明2个毒株均含有典型的强毒株F蛋白裂解位点112RRQKRF117;以F基因序列为基础构建遗传发育树,发现2株鸽源NDV属于基因Ⅵ型;F基因突变分析表明,鸽源NDVF基因突变率较大,且基因Ⅵ型和Ⅶ型存在规律突变;核酸和氨基酸序列同源性分析表明,国内鸽源NDV毒株核酸序列同源性为83.5%～99.7%,氨基酸同源性为85.6%～100%,且本研究分离的毒株与JS0722Pi同源性最高。     

2008-2009年部分地区新城疫病毒分离株的进化分析

本研究旨在从分子水平上掌握中国新城疫病毒的变异情况和新城疫的流行规律,对2008-2009年从中国部分省市养殖场分离的9株新城疫病毒毒株,采用RT-PCR方法扩增其F和HN基因,经克隆和测序,对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,9株分离株有8株为基因Ⅶ型,1株为基因Ⅱ型,F基因开放性阅读框架(ORF)为1662 bp,强毒株同La Sota的核苷酸同源性为83.5%~84.2%。HN基因开放性阅读框架(ORF)为1716或1734 bp,强毒株在538位缺失1个糖基化位点。结果表明,近年流行的ND疫情主要是由基因Ⅶ型NDV引起,F和HN基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。     

10株广西野鸟源新城疫病毒HN基因的遗传进化分析

对分离自广西4种鸟类的10株新城疫病毒(NDV)分离株,进行HN基因的RT-PCR扩增、序列测定和分析,旨在探讨广西野鸟源NDV HN基因的分子进化特征,为科学防控新城疫提供依据。结果显示,10株广西野鸟源NDV分离株HN基因的ORF全长均为1 716 bp,编码571个氨基酸,符合强毒株的基因长度特征。核苷酸同源性比较显示,2株鹧鸪源NDV分离株与NDV基因XII型同源性高达98.0%～98.1%, 5株斑鸠源和3株鸽子源NDV病毒与NDV基因VI型的同源性高达90.0%～91.9%。遗传进化分析显示,10株广西野鸟NDV分离株与我国经典强毒株F48E9、弱毒疫苗株LaSota和基因VII型NDV(我国目前应用最广的疫苗株基因型)遗传距离较远。