根癌农杆菌介导的苜蓿遗传转化体系的建立

苜蓿基因型是限制遗传转化的关键因素之一。从13份苜蓿材料中筛选出一份具有高频再生潜力的基因型一公农1号,并以该品种为受体转化Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因,优化了遗传转化条件,建立了农杆菌介导的苜蓿遗传转化系统,获得了大量的转基因植株,分子检测证实目的基因已经整合到苜蓿基因组中。     

苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的分析

蒺藜苜蓿的基因组较小,遗传转化相对容易,是国际上广泛用于研究豆科植物的模式植物,其全基因组测序已经完成。WRKY转录因子是近年来在植物中发现的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的新型转录调控因子, 调节启动子中含W-box元件的调节基因和(/或)功能基因的表达, 从而参与植物的各种防卫反应。本研究以苜蓿基因组序列(Mt2.0)为材料,利用生物信息学方法分析苜蓿全基因组WRKY转录因子基因的数目、种类、系统发生学、保守基序,结果表明,苜蓿中共有28个WRKY基因,其中5个基因含有2个WRKY结构域,共含有33个WRKY结构域,根据其结构域特点可以分为3个大类,同时与水稻WRKY基因进行了比较研究,发现基因数目远少于拟南芥和水稻,同时研究证实苜蓿与水稻WRKY基因的起源和进化关系存在较大差异,显示出苜蓿WRKY进化有其独特的特点,此外分析苜蓿WRKY基因的保守motif共有46个,筛选得到WRKY结构域的5个保守motif。该研究对苜蓿WRKY基因功能的研究及进化具有重要的意义。     

口蹄疫病毒抗原决定簇融合基因转化苜蓿

摘要：通过农杆菌的介导,以携带O型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21 O14 A21 HBcAg的植物表达载体转化苜蓿(Medicago sativa)愈伤组织,并再生得到抗性植株。试验建立了苜蓿甘农1号愈伤组织再生系统;优化了农杆菌介导的苜蓿遗传转化系统;获得抗性再生植株4棵;GUS报告基因在转化的愈伤组织中得到瞬时表达;抗性植株PCR检测结果证实目的基因已经成功整合到苜蓿基因组中。     

苜蓿SKU5基因的表达调控及其在秋眠中的作用

为了探索SKU5基因在紫花苜蓿（Medicago sativa L.）中表达调控规律和在苜蓿秋眠中的作用,本研究拟检测春、夏、秋季和人工条件下不同温度、不同日照长度下秋眠型和非秋眠型苜蓿叶片中SKU5基因mRNA相对表达量,分析同一秋眠型苜蓿品种不同时期SKU5基因mRNA相对表达量差异和不同时期2种秋眠型苜蓿品种间SKU5基因mRNA相对表达量的差异,以及SKU5基因mRNA相对表达量与苜蓿株高、叶面积、日照长度、温度的相关性。结果表明：SKU5基因的表达受日照长度极显著负调控,受温度极显著正调控;2种苜蓿叶片中SKU5基因的表达受日照长度和温度的调控结果不一致;秋眠型苜蓿叶中SKU5基因mRNA相对表达量与株高、叶面积呈显著负相关。因此,随着日照长度的缩短,SKU5基因高表达很可能促进秋眠型苜蓿的秋眠。     

紫花苜蓿抗逆基因工程研究进展

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界上最重要的豆科牧草之一,素有“牧草之王”的美称。近年来,苜蓿抗逆性研究越来越受到重视,利用基因工程技术改良苜蓿抗逆性是目前苜蓿育种中最有效的手段之一。本文主要综述了苜蓿遗传转化技术方法、苜蓿抗旱、耐盐、抗寒性等基因工程方面的研究进展,并对苜蓿基因工程研究今后的发展方向进行了展望。     

转基因苜蓿研究的现状和前景

简要综述了紫花苜蓿转基因研究的现状,介绍了外源基因转化苜蓿和构建转基因苜蓿植株的手段以及转基因苜蓿研究中的常见问题,展望了转基因苜蓿应用的前景,讨论了苜蓿转基因育种中的生物安全问题。     

水稻金属硫蛋白基因(rgMT)遗传转化的紫花苜蓿耐盐性分析

采用根癌农杆菌介导法将从水稻(Oryza sativa)中克隆出的一个金属硫蛋白基因(rgMT)转化到紫花苜蓿(Medicago sativa)品种"农菁1号"中,经PCR和Northern blot技术对获得的抗性植株进行了检测,证明rgMT基因已整合到苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。以野生型苜蓿为对照,对获得的转基因苜蓿株系在不同浓度NaCl、NaHCO3胁迫下的表型和生理指标测定发现,NaCl、NaHCO3胁迫处理后,野生型苜蓿受胁迫严重甚至死亡,转基因苜蓿受胁迫较轻。转基因苜蓿的脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性显著高于野生型(P0.05),细胞膜透性显著低于野生型,野生型苜蓿叶片中积累的过氧化氢高于转基因苜蓿的叶片中积累的过氧化氢。研究结果表明,rgMT基因已在苜蓿中表达,并且提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)叶片衰老的转录组分析

为探究蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）叶片衰老过程中相关基因的分子机制及代谢通路,本研究以其成熟叶片和衰老初期、中期、末期叶片为研究对象。通过转录组测序,比较4个发育阶段样品之间的转录组差异。结果表明,与成熟叶片相比,共筛选出2 990个差异表达基因（DEGs）,在所有衰老样本中表达水平均发生显著变化,其中有2 684条（89.77%）可进行基因功能注释;同时利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果证实了转录组测序的可靠性。进一步分析发现,DEGs涉及高等植物转录因子33个家族,包括ERF、WRKY、bHLH、MYB、NAC和bZIP。此外,还发现了837个与叶片衰老相关的基因。本研究发现了蒺藜苜蓿叶片衰老过程中大量差异表达的基因,为进一步分析蒺藜苜蓿叶片发育和衰老的调控机制提供参考。     

转OvBAN/bar双价基因的紫花苜蓿对虫蚀及除草剂的耐受性分析

以"甘农3号"紫花苜蓿为受体,利用农杆菌介导法导入双价基因OvBAN/bar,通过PCR检测和Southern杂交分析表明,4个转基因株系含有目的基因且均出现杂交条带,其中2个株系为单拷贝,1个株系为双拷贝,1个株系为三拷贝;对获得的4株转基因苜蓿进行qRT-PCR分析表明,具有三拷贝数的1个转基因株系OvBAN基因的表达量最高,其次为双拷贝数的2个转基因株系,并且这些株系的花青素还原酶活性及缩合单宁含量均显著高于野生型苜蓿。以过量表达OvBAN基因的3株转基因苜蓿为试验材料,进行抗蚜性和除草剂耐受性分析。结果表明,与野生型苜蓿相比,转OvBAN/bar基因苜蓿对苜蓿蚜都具有较好的抗性,蚜虫抑制率为78%~93%;用0.5%的市售草铵膦喷施各株系,10d后各转基因株系除个别叶片枯萎死亡,其他叶片及茎秆生长状况良好,而野生型苜蓿全部枯萎死亡,表明bar基因已整合到转基因苜蓿基因组中并稳定表达。综上所述,转OvBAN/bar基因紫花苜蓿表现出良好的抗虫性和除草剂耐受性。     

MADS-box基因家族在蒺藜苜蓿的全基因组分析

MADS-box基因家族是植物体内的重要转录因子,它们广泛地调控着植物生长、发育和生殖等过程。本研究以蒺藜苜蓿基因组数据为材料,采用结构域搜索方法,鉴定了138个MADS-box基因。通过序列比对系统进化分析,将它们分成两大类:Ⅰ型(92个)和Ⅱ型(46个)。同时,通过染色体定位分析发现,134个MADS-box基因定位在染色体上,还有4个MADS-box基因定位在尚未完成最终拼接的超长片段上。蒺藜苜蓿的MADS-box基因家族成员之间存在大量的基因重复,特别是Ⅰ型MADS-box基因,通过基因复制,MADS-box基因家族在染色体上形成多个密集的MADS-box基因簇。对蒺藜苜蓿的RNA-seq表达谱数据分析,发现MADS-box基因在心皮组织、花器官等组织中表达量较高,这表明蒺藜苜蓿的MADS-box基因家族广泛地参与苜蓿组织分化、发育以及生殖等过程的调控,这将为进一步揭示MADS-box类转录因子在蒺藜苜蓿中作用机制提供了重要的参考。     

利用基因枪共转化法获得转bar与P5CS基因黑麦草

以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)种子成熟胚为外植体进行高效诱导愈伤组织的组培条件,在此基础上用基因枪法轰击其成熟胚的愈伤组织,共转化分别携带bar基因和P5CS基因表达框架的2种质粒,经1.2‰草丁磷(Glufosinate)抗性筛选获得了转基因再生植株.经聚合酶链式反应(PCR)检测筛选到整合bar基因的株系18个,遗传转化率为0.72%,其中5个检测到P5CS,共转化效率为27.8%.     

猪附红细胞体ORF2的全基因合成、表达与鉴定

通过重叠区扩增法（PCR-based accurate synthesis,PAS）人工合成猪附红细胞体ORF2基因,并使其在大肠杆菌（DE3）中高效表达。根据GenBank注册的AJ504999的ORF2基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成11对寡核苷酸片段,用PAS方法,人工合成ORF2基因。基因克隆入pMD18-T载体,经测序证实正确后,连接到表达载体PET-28a,获得重组表达质粒PET-28a/ORF2,导入大肠杆菌BL21（DE3）,在37℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,Western-blot鉴定,在35 000附近出现目的片段。同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构及抗原表位等方面进行预测。     

兔出血症病毒主要结构蛋白基因的克隆、原核表达及其免疫原性鉴定

本试验采用RT-PCR方法扩增了兔出血症病毒(rabbit haemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后,进行序列测定,将测序正确的纯化产物双酶切,克隆入原核表达载体pET28b(+)中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E.coli Rosetta^TM,用IPTG诱导培养重组表达菌。经SDS-PAGE分析,在分子质量62.0 ku处可见明显的表达带,经Western blotting检测,约在62.0 ku处出现特异性的反应带。结果表明,表达蛋白具有良好的抗原性。     

鸡大肠杆菌iss基因的克隆测序及原核表达

本实验对鸡大肠杆菌O2血清型菌株进行iss基因克隆测序，并在此基础上设计出两对套式引物，分别对含信号肽Miss基因序列和不含信号肽Miss基因序列进行扩增，并与原核表达载体pGEX-6p-1连接进行原核表达。iss基因克隆测序的结果与两组国外发表Miss基因序列进行比对，其同源性达100％。SDS—PAGE鉴定显示融合蛋白获得了较理想的表达，融合蛋白分子量分别约为36kD和33kD。     

口蹄疫病毒RNA复制酶基因3D的克隆、表达及纯化

利用RT-PCR扩增了口蹄疫病毒(FMDV)的RNA复制酶基因，并将其克隆到原核表达载体pET-32a( )中。重组质粒在大肠杆菌中表达后的目的蛋白为可溶性形式，纯化产物用感染A型FMDV的豚鼠康复血清进行Western-blotting检测，结果表明，3D基因得到了正确的表达。     

马动脉炎病毒GL、M和N蛋白主要抗原域的原核表达及抗原性鉴定

采用RT—PCR方法从EAVBucyrus株扩增了截短的GL、M和全长的N基因片段,将三者分别克隆到表达载体pGEX-6p-1中,测序验证后转化Rosetta（DE3）宿主菌中经IPTG诱导表达,诱导后菌体裂解物经SDS-PAGE分析。试验结果表明,重组菌表达出约35000、34000和38000的特异性条带,通过条件优化及切胶纯化获得较高浓度的目的蛋白。经Western-blot和间接ELISA分析,纯化的蛋白只与抗马动脉炎病毒阳性血清发生特异性反应,证实该蛋白具有良好的反应原性和特异性。     

羊种布鲁氏菌LpxB基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析

试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增得到大小为1 188 bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21（DE3）中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。     

Cloning,Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of LpxB Gene of Brucella melitensis

The study was aimed to clone and express LpxB gene,and perform the bioinformatics analysis of protein.The genomic DNA of Brucella melitensis M5-90 was used as template.According to the genome sequence of M5-90 on GenBank,a pair of primers was designed.LpxB gene,which was 1 188 bp,was amplified by PCR,and was ligated into pMD20-T vector.The constructed recombinant plasmid pMD20-T-LpxB was transformed into E.coli DH5α.The recombinant plasmid was confirmed by endonuclease digestion and sequencing.The coding region of LpxB from pMD20-T was digested by BamHⅠ and XhoⅠ.Then,the fragment was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a,and the positive plasmid was named pET-28a-LpxB.The pET-28a-LpxB was transformed into E.coli BL21 (DE3).The expressed protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.DNAMAN and BioEdit softwares were used to analyze the sequence of amino acids encoded LpxB gene.The results showed that the CDS of LpxB was successfully cloned and expressed.The secondary structure of LpxB protein consisted structure α -helix,extended strand,β-turn and random coil which accounted for 52.41％,14.94％,8.10％ and 24.55％,respectively.     

新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin在毕赤酵母中的表达

前期采用差减杂交的方法筛选到新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin,其基因全长为477 bp,编码159个氨基酸,理论分子量约17.4 kDa。为了获得具活性的大量表达的抗菌肽,本研究利用毕赤酵母表达了elecilin。首先将elecilin基因克隆至酵母分泌表达载体pPICZaA,构建了重组分泌表达质粒pPICZaA-elecilin,电击转化毕赤酵母X-33。经Zeocin筛选和PCR鉴定,获得重组酵母菌,通过甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定,证实诱导后的培养基中存在与预期分子量大小相一致的蛋白,能被His-tag单克隆抗体识别,表明利用酵母成功表达了欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin。这为进一步研究该抗菌肽的功能及作为饲料添加剂的应用奠定了基础。     

鸡白细胞介素-2原核表达与生物学活性初探

根据pGEX-6p-1表达载体多克隆位点,设计带有限制性内切酶酶切位点的IL-2引物,RT-PCR克隆获得目的基因,连接pGEM-T载体,转化JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选、测序和双酶切鉴定,与pGEX-6p-1表达载体连接,转化BL21感受态细胞,经双酶切和PCR鉴定,用IPTG诱导表达,通过菌体裂解、包涵体洗涤、溶解、复性、Sepharose 4B柱层析,SDS-PAGE和Western blot检测,证明表达并纯化了IL-2融合蛋白,而且纯化的IL-2融合蛋白具有促进淋巴细胞增殖的特性.