家蚕丝腺组织Actin3引物非特异性扩增片段的鉴定及A3引物扩增条件的优化

肌动蛋白基因3（Actin3）是家蚕分子生物学研究中检测组织cDNA模板质量常用的标志基因之一。我们在用实验室通用的Actin3引物扩增检测家蚕不同茧色品种（白血白茧品种夏芳、金色茧品种金一、黄血白茧品种03—000、锈色茧品种03—520）中肠、血液、丝腺组织cDNA时,发现以不同茧色品种丝腺组织cDNA为模板都能扩增出一条非特异性的小片段,而在中肠和血液组织cDNA的扩增产物中不存在。本研究对该丝腺特异的扩增小片段扩增产物进行了克隆鉴定,分析了其出现的原因,并探索了A3引物扩增的最佳扩增条件。     

家蚕黄茧候选基因Cameo1和Cameo2在不同茧色品种的表达差异与功能分析

外层黄茧C基因是家蚕对体内类胡萝卜素选择性吸收的关键基因之一。以13个黄红茧系品种(包括1个限性黄茧品种)、7个绿茧系品种、1个白色茧品种为材料,采用RT-PCR方法,检测和分析C基因的2个候选基因Cameo1和Cameo2在4龄和5龄幼虫不同组织的表达差异。结果表明,丝腺对黄茧色素类胡萝卜素的吸收不依赖于Cameo1基因的表达,Cameo1基因表达没有茧色和性别特异性,其蛋白产物可能没有直接参与黄茧色素吸收,而是作为B族清道夫受体家族(SCRB)成员在家蚕免疫系统中发挥作用;虽然Cameo2基因的蛋白产物介导了中肠中的黄色茧主要色素成分叶黄素的主动运输方式,但Came-o2基因不只是在家蚕黄色茧品种中肠的特异表达基因,Cameo2基因在家蚕中肠以外的组织表达特异性与这些组织的黄茧色素积累密切关联,生殖腺可能是比中肠和丝腺更加重要的Cameo2基因表达和作用的组织。     

家蚕黄血近等基因系SSH文库的构建及部分EST的序列分析

以家蚕黄血品系KY和白血品系HB构建家蚕黄血近等基因系。用回交18代的家蚕黄血基因(Y)近等基因系群体中的黄血个体和白血个体中肠为材料,构建了家蚕黄血近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。从该抑制消减杂交cDNA文库随机挑选出46个阳性克隆进行测序,并用CAP3软件聚类拼接,得到4个假定基因(contig)和9个已知功能基因(unigenes)。通过BLAST比对和对所得表达序列标签(EST)的同源分析表明,这些基因主要涉及能量代谢因子、RNA分子水平相关调节因子、酶类、结构蛋白等,由此初步探明了参与黄血基因(Y)协同作用的相关基因表达蛋白的种类和数量,可为进一步研究蚕茧着色的分子机制及通过遗传选择培育天然有色茧品种提供基础信息。     

家蚕不同茧色品种中尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶(UGT)基因的表达差异

尿苷二磷酸-葡萄糖基转移酶(UGT)是动物糖基化作用的关键酶。黄酮类色素是家蚕天然彩色茧中主要色素之一,桑叶中的黄酮色素在蚕体内需通过糖基化修饰才能够进行生物转化。为了研究UGT对家蚕茧色的影响,选取在家蚕绿色茧品种大造丝腺或中肠中有表达的7个家蚕UGT基因(UGT59、UGT30、UGT60、UGT34、UGT86、UGT89、UGT65),用RT-PCR方法对这些基因在白茧品种C108和皓月、绿茧品种大造和G1、黄茧品种Y12和黄茧限性品种Ys的丝腺、中肠和生殖腺组织中的表达进行了定性与定量分析。结果显示,上述品种中UGT89和UGT65基因只在丝腺特异表达;UGT86基因在丝腺的表达量最高,无茧色特异性;UGT60和UGT34基因在有色茧品种的中肠组织特异性表达;UGT59和UGT30基因在绿茧品种的丝腺和中肠组织特异性高量表达,UGT30基因在不同茧色品种还存在mRNA转录本的差异,显示出茧色特异性。对限性黄茧品种Ys的调查显示,UGT60和UGT86基因的表达在生殖腺存在性别差异,而在丝腺和中肠组织没有性别差异。提示UGT60和UGT34基因的表达与天然彩色茧色素在中肠的吸收有关,UGT59和UGT30基因表达与绿茧色形成有关,而UGT60和UGT86基因在生殖腺的差异表达与性别可能存在关联。     

日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆和分析

为筛选新的有潜在保护性的抗原分子编码基因，采用重复感染兔血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，将阳性克隆的插入序列进行了PCR扩增和序列分析。结果发现，所筛选的阳性克隆中有2个为日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(SPI)。序列分析表明，它可编码分子质量为4．6ku，等电点为5．76的蛋白，与GenBank中日本血吸虫SPI基因(大陆株)、曼氏血吸虫SPI基因和埃及血吸虫SPI基因编码的氨基酸序列的同源性分别为98％、62％和62％。TMpred分析表明，该蛋白具有2个明显的跨膜区即36～55和356～372位氨基酸。     

家蚕丝腺Matchmaker cDNA文库的构建和3种蚕丝蛋白基因转录因子编码区的克隆

采用Clontech公司SMARTTM技术,分别构建了家蚕4龄眠蚕后部丝腺(PSG0)以及5龄第3天后部丝腺(PSG3)、中部丝腺(MSG3)和脂肪体(FAT3)的Matchmaker cDNA文库,用A3基因引物对几个文库的质量进行了检测;从cDNA文库和家蚕基因组中克隆了FMBP-1、POU-M1和BmFkh 3种在蚕丝蛋白基因表达调控中起重要作用的转录因子编码区,并对其序列进行了分析。结果表明,所建cDNA文库能够用于利用酵母的杂交系统开展蚕丝蛋白基因的表达调控研究。     

家蚕黄茧近等基因系SSH文库的构建及部分EST序列分析

以家蚕黄茧品系KY(YYCC)和白茧品系C108(+Y+Y+C+C)组配黄茧(C)近等基因系。挑取回交11代的黄茧(C)近等基因系群体中的黄血个体的黄色和浅黄色中部丝腺作为实验材料,构建家蚕黄茧近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。通过对SSHcDNA文库中随机挑选的104个阳性克隆测序和聚类拼接,得到15个假定基因(contig)、25个已知功能基因(unigenes)和5个未知功能基因(unknown)。获得的表达序列标签(EST)经Blast比对和同源性分析,初步发现这些基因参与家蚕体内能量代谢、基因转录、信号传导、物质转运、细胞生长分裂、细胞结构形成、蛋白质合成与降解、核酸及蛋白质加工、机体防御等诸多生物学过程。分析结果可作为深入研究家蚕茧着色分子机制的基础信息。     

家蚕Ssu72蛋白基因的克隆及序列与表达分析

Ssu72(suppressor of sua7-1 clone 2)蛋白的命名源于对酵母sua7-1基因突变的抑制作用,推测其在真核生物RNA聚合酶Ⅱ作用的转录过程中有重要功能。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到家蚕Ssu72蛋白基因(BmSsu72)的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该基因ORF为579 bp,编码蛋白质含有192个氨基酸残基,具有完整的Ssu72保守结构域,三级结构包含9个α螺旋和4个β折叠,推测α螺旋和β折叠之间可能形成锌指结构。以家蚕蛹cDNA为模板PCR克隆到BmSsu72基因的完整ORF序列,通过构建载体pET-28a(+)-BmSsu72在大肠杆菌中表达并纯化了重组BmSsu72蛋白,进而利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用荧光定量PCR检测到BmSsu72基因随着家蚕的生长发育转录水平呈逐渐下降趋势,在卵期的转录水平最高,在蛾期的转录水平最低;该基因在5龄幼虫各组织中的转录水平以马氏管最高,卵巢和丝腺次之。Western blotting检测BmSsu72在家蚕5龄幼虫各个组织中均有表达,其中在丝腺中的表达水平最高。推测BmSsu72可能与家蚕丝腺的分泌相关。     

梅花鹿茸角组织BSPⅡ基因全长cDNA的克隆及序列特征分析

从梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库中克隆了与骨形成和骨改建有关的一种新的骨生长因子BSPⅡ基因的全长cDNA序列,并结合生物信息学方法和实时荧光定量RT-PCR技术对该基因的氨基酸序列及其在鹿茸尖端不同组织层的表达情况进行了分析。结果表明,BSPⅡ基因cDNA全长为1576bp,编码311个氨基酸。经生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白具有N端信号肽及跨膜区,相对分子质量为34100,理论等电点为4．05,其一级结构中谷氨酸所占比例最高;二级结构元件主要以α-螺旋和无规则卷曲为主;同源序列分析表明,梅花鹿与欧洲牛BSPⅡ氨基酸的相似性最高（93％）;多重序列比对显示,此蛋白的N-端和68～215、265～308位谷氨酸富集区高度保守;系统进化树显示,在该基因座位上梅花鹿与马的亲缘关系较近,来源于同一个分化支。实时荧光定量RT—PCR分析表明,该基因的表达与鹿茸组织的矿化进程呈显著正相关,推测该基因在鹿茸组织矿化过程中起到了重要的调节作用。     

中国地方品种丝羽乌骨鸡白细胞介素2基因的克隆及遗传进化分析

鸡白细胞介素2（ChIL-2)是近年来新发现的一类细胞因子。根据Sundick等发表的鸡IL-2基因序列设计一对特异性引物,从ConA体外激活的脾脏淋巴细胞中提取mRNA,通过RT-PCR方法扩增和克隆了我国地方品种丝羽乌骨鸡IL-2cDNA,丝羽乌骨鸡IL-2基因由734nt组成,编码-由143个氨基酸组成的前体蛋白,基因5’端含有17个核苷酸和3'端含有285个核苷酸组成的非编码区,3'UTR中含有4个重复的“ATTTA”序列。编码蛋白氨基酸与Kestrel,Obese和SC品系的来杭鸡比较,氨基酸的突变主要发生在28-32位,这一区域丝羽乌骨鸡和Kestrel来杭鸡相同,Obese和SC鸡相同,基因系统进化树分析表明丝羽乌骨鸡和Kestrel来杭鸡具有很近的亲缘关系,Lbese和SC鸡具有很近的亲缘关系。中国的药用鸡品种-丝羽乌骨鸡在非常保守的133位发生了氨基酸突变,我们推测这可能与该品种鸡具有很强的抗病能力有关。     

家蚕有色茧主要色素物质在幼虫体内的代谢变化

为探讨有色茧色素物质在蚕体内的代谢机制,检测了有色茧主要色素物质的含量及其在家蚕5龄幼虫不同时期中肠、血液、丝腺组织中的消长变化,分析色素物质从中肠进入血液再转运到丝腺的时序差异。有色茧中,黄茧的色素以类胡萝卜素化合物为主,绿茧的色素以黄酮类化合物为主。黄酮类化合物、类胡萝卜素化合物在家蚕5龄幼虫中肠、血液、中部丝腺、后部丝腺中的含量均呈现龄初低、龄末高的趋势,其中,黄酮类化合物在熟蚕组织中的含量是中肠>血液>中部丝腺>后部丝腺;类胡萝卜素化合物在熟蚕组织中的含量是中部丝腺>后部丝腺>中肠>血液。2种色素物质含量变幅最大的是后部丝腺组织,结黄茧蚕和结绿茧蚕的黄酮类化合物分别增加406.55%、202.50%,类胡萝卜素化合物分别增加211.80%、250.84%。黄酮类化合物在5龄幼虫丝腺组织的绝对含量是结绿茧蚕大于结黄茧蚕,类胡萝卜素化合物在5龄幼虫丝腺组织的绝对含量是结黄茧蚕显著大于结绿茧蚕,与在不同颜色蚕茧中检测到的2种色素物质含量一致。研究结果提示:黄酮类化合物在5龄幼虫中肠组织中积累较多,类胡萝卜素化合物在丝腺组织中积累较多;丝腺组织中2种色素物质的含量与茧色密切相关;来自桑叶中的2种色素物质经中肠消化吸收后,再通过血液进入丝腺组织并产生累积效应。     

茧丝纤度与强伸性能的相关性分析

本实验主要研究家蚕茧丝纤度与强伸性能之间的相关性，结果表明：①家蚕不同品种间茧丝纤度和断裂强力、伸长率的相关系数分剐为0．654、-0．181；②家蚕同一品种不同个体间的茧丝纤度和强伸性能均呈较明显的正（或负）相关性，但未达到显著水平；③同一个体不同茧层的茧丝纤度和强伸性能之间大部分呈显著或极显著正相关。本研究结果初步表明，茧丝纤度与强伸性能之间的相关性大小：不同茧层〉同一品种不同个体〉不同品种。     

家蚕Bmtdh基因的克隆与序列分析

克隆了家蚕苏氨酸脱氢酶基因(Bmtdh),其cDNA长1 310 bp(No.ABA43639.1),包括227 bp 5′-UTR和1 026 bp的完整开放读码框(ORF)。Bmtdh在家蚕基因组上以单拷贝形式存在,编码342个氨基酸,其Ile29-Val322区域是一个完整的表面异构酶功能域。表达谱分析与EST数据的分析表明,Bmtdh在丝腺和卵巢中的转录水平高于其它组织,并且Bmtdh在家蚕4龄眠期、5龄早期的转录水平也很高,而在卵期(G2胚胎)和1龄早期没有检测到其转录表达,表明Bmtdh基因可能参与了蚕丝蛋白的合成过程。     

家蚕质型多角体病毒感染应答的假定蛋白基因全长cDNA克隆与表达特征分析

在感染家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个差异表达的假定蛋白基因。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该假定蛋白基因的全长cDNA。用生物信息学方法进行基因序列与结构分析表明:该基因全长cDNA序列为486bp,包含108bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和153bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR),开放阅读框(ORF)为225bp,编码74个氨基酸,蛋白分子质量为6.888kD,等电点为5.27;该基因由3个外显子和2个内含子组成,ORF位于第2外显子内,编码蛋白含二次跨膜结构,多肽链表现为疏水性,在多肽链上的第15～16氨基酸残基可能是信号肽的切割位点。RT-PCR结果显示该基因在家蚕5龄幼虫的丝腺、血液、脂肪体、生殖腺及中肠组织中均有表达;荧光定量PCR结果表明该基因在感染Bm-CPV的家蚕中肠组织中的表达水平为正常家蚕中肠组织的6.28倍。研究结果为进一步解析该基因的功能奠定了基础。     

粗纤度家蚕品种C华×JD的育成

根据茧丝纤度性状的遗传规律 ,采用直接选择和间接选择相结合的方法 ,育成了 1对茧丝纤度 4 5dtex的粗纤度家蚕品种C华×JD ,其单产达 4 4 2kg/盒种 ,茧丝长 10 0 0m、解舒丝长 70 0m以上 ,适合于生产粗旦生丝。     

中国野桑蚕抗病毒蛋白基因(Lipase)的克隆与活性鉴定

从中国野桑蚕幼虫中肠细胞克隆获得了抗家蚕核型多角体病毒BmNPV的脂肪酶基因(Lipase)cDNA(GenBank:AY945212)。该基因cDNA大小906 bp,编码301个氨基酸,蛋白质分子质量约为28.9 kD。进一步克隆了其全长基因组,结果表明该基因由2 147 bp组成,包含4个外显子和3个内含子。该基因在野桑蚕体内的表达具有组织特异性,仅限于野桑蚕中肠组织表达,且在幼虫龄中表达水平较高,而在幼虫眠期和熟蚕期几乎没有表达。通过基因体外表达获得的重组蛋白Lipase,能够有效抑制BmNPV病毒对家蚕的感染,说明该蛋白具有较强的抗BmNPV的生物学活性。     

家蚕品种“菁松×皓月”的蚕茧荧光显色判性改育试验

菁松×皓月是生产上推广量最大的春用多丝量家蚕品种,根据家蚕茧荧光色的遗传机制,将该品种改育成具有蚕茧荧光显色判性性状的品种。对蚕茧有多种荧光显色的菁松通过系统分离方法,对蚕茧单一荧光显色的皓月通过杂交导入荧光伴性基因Fx及定向培育的方法,将2个品种均改育成雄蚕茧为黄荧光色、雌蚕茧为紫荧光色的品种,其荧光判性准确率达到100%。2个改育的品种暂命名为苏杰、豪胜。实验室饲养鉴定成绩表明改育品种杂交组合苏杰×豪胜的幼虫比菁松×皓月发育快,体质更强健,但全茧量略低;缫丝鉴定苏杰×豪胜的茧丝纤度2.686 dtex,洁净95.5分,茧丝长1 300 m以上,解舒率75%以上,并且生丝匀度好。改育品种杂交组合苏杰×豪胜的主要经济性状成绩与菁松×皓月相仿,在生产上推广应用可以达到雌雄蚕茧分别缫丝和提高蚕种制造鉴蛹工效的目的。