用冻干菌液进行猪丹毒、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗效力检验的研究

在猪丹毒、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的效力检验中,需要进行动物攻毒保护试验。传统方法使用的是2~8 ℃保存的新鲜菌液对试验动物进行攻毒。本研究中使用的是低温保存的冻干菌液,并对冻干保存的菌数进行了测定和优化。结果表明,冻干保存的菌液能达到新鲜菌液同等的检验结果。同时,对冻干菌液保存期进行试验验证,发现细菌存活状态稳定。因此,在猪丹毒、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗效力检验中,可将新鲜的攻毒菌液冻干保存,用于攻毒保护试验,以避免每次繁重的新鲜菌液前期准备工作,并克服活菌数衰减所造成的检验结果不准确等问题。     

兔多杀性巴氏杆菌制苗菌液灭活工艺的试验报告

为了优化疫苗制造过程中的灭活工艺，本课题组针对甲醛的使用浓度以及灭活时间进行了试验。试验结果表明，兔多杀性巴氏杆菌JN株菌液按0．2％的比例（v／v）加入甲醛溶液，37℃条件下灭活48h，灭活彻底，以该灭活工艺制备的免多杀性巴氏杆菌灭活菌液注射试验兔，试验兔10／10健活，注射部位无炎性反应，试验兔采食量、饮水量无明显异常变化，精神状态良好，表明该灭活工艺灭活的菌液安全性良好，该灭活工艺切实可行。     

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗的研制

试研制5批兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗,共计16.3万头份。疫苗安检、菌检均合格,效力检验试验对兔病毒性出血症总保护率为100%,对兔多杀性巴氏杆菌病的总保护率为84%,疫苗分派山东多家养兔单位应用,反馈信息表明,疫苗安全、有效,能有效预防兔病毒性出血症和兔多杀性巴氏杆菌病。     

猪牛巴氏杆菌病灭活疫苗的研究Ⅰ．制苗用菌种选择、制苗工艺、疫苗安全性及效力和保存期试验

通过猪源、牛（黄牛、水牛、牦牛）源巴氏杆菌交互免疫试验，选出一株免疫原性良好的荚膜Ｂ型多杀性巴氏杆菌，用其培养菌液，经灭活后加氢氧化铝胶，再进行适当浓缩后，制成猪牛巴氏杆菌病灭活疫苗（简称Ｂ型苗）。疫苗以２倍使用剂量注射奶牛和猪均无异常反应，证明安全。试制的１４批疫苗用兔作效力检验，总保护率达８３．９２％，比原《规程》猪肺疫苗或牛出败苗的总保护率提高２０％左右；４批Ｂ型苗用猪效检，符合规程标准，表明效力良好。疫苗在０－８℃保存，有效期可达一年以上。     

猪巴氏杆菌病二价（A、B群）灭活疫苗的研究──Ⅱ、疫苗安全、效力及保存期试验

以７、８和５批多杀性巴氏杆菌二价灭活疫苗样品接种小鼠、兔和仔猪分别测定疫苗的安全性、效力和保存期。结果表明，用于测定安全性的动物全部健活；用于检测疫苗效力的７１．８％的兔子和７５％的仔猪获得保护抵抗多杀性巴氏杆菌Ａ群菌株的攻击；９３．７％的兔子和８３．３％的仔猪能抵抗Ｂ群菌株的攻击。在０－８℃中保存１５个月的疫苗效力不下降。     

兔多杀性巴氏杆菌培养工艺的研究报告

本试验通过对兔多杀性巴氏杆菌培养基的选择、培养工艺以及微生物发酵罐扩大培养的条件进行了研究，试验结果表明：含0．1％裂解血球全血的马丁肉汤培养基适用于兔多杀性巴氏杆菌JN株二级种子液的培养，以及微生物发酵罐生产兔多杀性巴氏杆菌菌液的扩大培养。免多杀性巴氏杆菌JN株微生物发酵罐培养的优化条件：含0．1％裂解血球全血的马丁肉汤培养基pH值为7．2～7．6，二级种子接种量为2％～3％，通气量为5～6L／min，搅拌速度为100～150r／min，37℃条件下培养14～16h。     

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗研制

以具有良好免疫原性的兔病毒性出血症病毒野毒WF株和兔多杀性巴氏杆菌C51-17株作为种子,研制出了兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌二联蜂胶灭活苗,并对疫苗进行了免疫剂量、免疫产生期、免疫保护期、保存期等试验,确定出二联苗免疫剂量1.0mL,二联苗在免疫后5天对兔病毒性出血症强毒的保护率达到100%,免疫后10天对兔多杀性巴氏杆菌的保护率均达到80%,二联苗分别在免疫后6个月用兔出血症强毒攻击仍产生100%保护,在6个月用1个MLD的兔多杀性巴氏杆菌攻击保护率可达80%以上,二联苗4~8℃条件下保存期暂定为18个月。     

不同方式制备的猪胃消化液对培养猪多杀性巴氏杆菌（EO630株）的影响

在猪多杀性巴氏杆菌(EO630株)的菌液生产中,使用不同方式制备的猪胃消化液马丁汤培养基生产猪多杀性巴氏杆菌菌液,菌液菌数差异明显。结果表明用温室消化的猪胃消化液制备的马丁汤培养基有利于提高培养菌数。     

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗与相应单苗免疫效力的比较试验

兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗分别与两种单苗进行免疫效力、免疫持续期及保存期的试验,试验结果表明:二联蜂胶灭活疫苗对兔病毒性出血症的免疫保护率为100%(10/10),对多杀性巴氏杆菌病的免疫保护率为90%(9/10),而两种单苗的免疫保护均为100%(10/10);二联苗和单苗免疫后第3天对兔病毒性出血症产生部分免疫力,至第10天产生坚强免疫力而对多杀性巴氏杆菌第14天产生坚强免疫力;二联苗和单苗免疫6个月后,对兔病毒性出血症的免疫保护为100%(10/10),对多杀性巴氏杆菌病的免疫保护为90%(9/10);二联苗和单苗在2~8℃和室温条件下保存15个月后,对兔病毒性出血症的免疫保护为100%(10/10),对多杀性巴氏杆菌病的免疫保护为90%(9/10)。二联苗中两组分的配比科学合理且两者之间无干扰作用。     

兔源A型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种特异性强且敏感性高的兔源A型多杀性巴氏杆菌快速检测方法，本研究以兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因为目的基因，设计2对特异性引物进行双重PCR扩增，经反应条件优化，建立检测兔源A型多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法。该方法的最佳退火温度为57.8℃，最佳混合引物浓度为0.8μmol/L。该方法特异性强，对兔源A型多杀性巴氏杆菌为kmt1和hyaD基因双阳性，对兔源D型和F型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因单阳性，对兔源其它细菌性病原和阴性对照则均为阴性。该方法敏感性高，对兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因的最低检出限分别为1×10³拷贝/μL和1×10⁴拷贝/μL。该方法重复性好，且与已报道的多重PCR方法的符合率高达96.12%。本研究建立的双重PCR方法对兔源A型多杀性巴氏杆菌具有良好的特异性和敏感性，且重复性好、准确性高，为该病原的快速检测提供了有力的技术支持。     

猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗（EO630株）生产用合成培养基的研究

为便于猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗（E0630株）质量控制和降低生产成本,研制了ZJ-1和ZJ-2两种合成培养基,并进行了两种合成培养基与马丁肉汤的比较试验。结果表明,合成培养基ZJ-1培养活菌数高于ZJ-2和马丁肉汤。用合成培养基ZJ-1培养制备3批疫苗,并分别用兔进行安全检验和小鼠效力检验。3批疫苗对兔均2／2健活,对小鼠的保护力分别为9／10、9110、8／10,符合产品质量标准。本试验表明,运用合成培养基替代传统培养基是可行的。     

1株猪源病原菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

通过对一起病死猪的实验室诊断 ,从病猪心血、脏器中分离到了 1株对小白鼠和家兔都具有较强致病性的细菌。经显微镜观察、培养特性观察、生化特征鉴定 ,此菌为多杀性巴氏杆菌 ,但此菌与其他多杀性巴氏杆菌不同的是它能利用水杨素、鼠李糖、阿拉伯糖。 O抗原琼脂扩散试验鉴定此菌菌体抗原为 O1型 ;Carter间接血凝试验法检验荚膜抗原类型此菌为 A型。体外滤纸扩散法检验此巴氏杆菌对药物敏感性 ,试验表明该菌耐青霉素、土霉素、四环素、磺胺嘧啶、痢特灵、阿米卡星、头孢唑啉 ;但对庆大霉素、卡那霉素、盐酸环丙沙星、氟哌酸敏感 ,对氨苄西林 ,链霉素中度敏感。自制灭活苗进行免疫原性实验检测 ,本分离菌疫苗对小白鼠和家兔保护率约为 70 % ,而市售巴氏杆菌疫苗对小白鼠和家兔保护率约为 3 0 %～ 40 %。     

马丁琼脂培养基质量控制标准研究

为建立马丁琼脂培养基质量控制标准,系统评价马丁琼脂培养基适应性和促生长能力,运用多杀性巴氏杆菌、丹毒杆菌和链球菌类活疫苗活菌计数参考品,通过活菌计数统计分析,对新鲜马丁琼脂、干粉马丁琼脂或改良马丁琼脂进行适应性和促生长能力系统测试。结果显示：新鲜马丁琼脂、干粉马丁琼脂和改良马丁琼脂均对多杀性巴氏杆菌、丹毒杆菌、链球菌的适应性和促生长能力差异显著,需同时选择巴氏杆菌类、丹毒杆菌类、链球菌类活疫苗计数参考品评价马丁琼脂培养基的适应性和促生长能力,表明活菌计数参考品用于建立马丁琼脂质量控制标准是可行的。     

兔出血症-巴氏杆菌病二联灭活苗的研制

筛选出了具有良好免疫原性的兔瘟强毒株GMH881和兔巴氏杆菌C51-17株,研制出了兔出血症-巴氏杆菌二联灭活苗,对疫苗进行了免疫剂量、免疫产生期、兔出血症抗体测定、免疫保护期、保存期等试验：确定出二联苗免疫剂量1.0 mL;二联苗在免疫后5 d对兔病毒性出血症强毒的保护率达到100%,二联苗免疫后7d对兔巴氏杆菌的保护率均达到80%以上;二联苗的兔病毒性出血症抗体测定,结果表明,二联苗免疫家兔后7d HI抗体均可达22.75,15 d明显上升,二联苗HI效价30 d达到最高峰,可达28.0,二联苗在60~120 d均可维持在27.0~25.5水平,到180 d时抗体水平面略有下降为25.25,二联苗分别在免疫后4个月、6个月用兔出血症强毒攻击均产生100%保护,在6个月用2个MLD的兔巴氏杆菌攻击保护率可达70%以上,二联苗4~8℃条件下保存期暂定为1年,25℃条件下暂定为半年。     

猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗抗原菌选择性显色培养基的研发和应用

为研制便于检测猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗抗原含量的选择性显色计数琼脂(以下简称猪三联显色培养基)以代替传统的马丁琼脂,对比研究了干粉马丁琼脂、新鲜马丁琼脂和猪三联显色培养基的理化特性和生长特性,并通过活菌计数方法平行对比了猪丹毒单价苗、猪肺疫单价苗和猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗的抗原含量.结果显示,猪三联显色培养基在活菌...     

禽霍乱油乳剂灭活菌苗的研究

选用免疫原性好的５Ａ和７Ａ血清型巴氏杆菌菌株，分别接种于马丁肉汤通气培养。要求每ｍｌ的含菌量达１００亿以上。经０．５％福尔马林灭活后，等量混合为水相。１０＃白油为油相，按适当比例制成油乳剂灭活菌苗。与禽霍乱弱毒菌苗和禽霍乱氢氧化铝菌苗，分别接种于同群蛋鸡作对比试验。结果证实油乳剂灭活苗在安全性和免疫原性方面都优于后两种疫苗，５个月的攻毒保护率达８０％。经广泛的区域试用，从反馈信息和实地调查结果说明本菌苗对各种日龄的鸡、鸭、鹅都能有效地预防和控制禽霍乱的发生或流行。     

六安地区禽霍乱分离株与疫苗株抗原性的比较

六安地区是禽霍乱常发地区，生产上常出现禽霍乱疫苗免疫效果不理想的情况。通过菌体凝集试验、双向琼脂扩散试验和免疫保护试验比较临床分离到的禽多杀性巴氏杆菌与疫苗菌体的抗原性差异，发现两者的抗原性有明显不同，推测这是禽霍乱灭活疫苗在本地区使用效果不理想的主要原因之一。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）灭活疫苗菌株，本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株，测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价，并进行了攻毒保护试验。结果显示，分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多，均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因；免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应，在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128，强毒攻毒后全部存活，而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明，Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株，其中Pm3作为首选株。     

鸭疫里默氏杆菌贵州流行株蜂胶灭活疫苗制备

【目的】制备鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)贵州流行株蜂胶灭活疫苗。【方法】选取RA血清2型贵州流行株(RA-SS-8株)为基础菌株,依次利用分光光度法和平板计数法测定细菌生长曲线,再进行灭活条件筛选,以蜂胶为佐剂制备RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,并进行无菌检验、安全性检验及免疫鸭攻毒保护性试验。【结果】分光光度法测定RA-SS-8株菌液D_{600 nm}值随培养时间变化显示,细菌在0~3 h时增殖缓慢,在3~10 h时增殖趋势明显加快,在10 h以后增殖逐渐趋于平缓,随着培养时间的延长,细菌最终进入衰亡期;平板计数法结果显示,RA-SS-8株D_{600 nm}值为0.1~0.8时,该菌处于对数生长期,且D_{600 nm}值与活菌数呈现良好的线性关系;RA-SS-8株最佳灭活条件为0.2%甲醛溶液、37 ℃灭活12 h;蜂胶灭活疫苗含菌量为3.8×10⁹ CFU/mL,蜂胶干物质含量为10 mg/mL;无菌检验巧克力琼脂培养基上未见菌落生长;安全性检验以2倍免疫剂量接种雏鸭在观察期内未表现出不良反应,大体病变观察未见明显病变;免疫鸭攻毒保护性试验显示,蜂胶灭活疫苗免疫组鸭对RA-SS-8株的攻击后保护率为70%,蜂胶灭活疫苗对试验鸭心脏、肝脏组织均具有良好的保护效果。【结论】本研究成功制备了RA贵州流行株蜂胶灭活疫苗,为蜂胶灭活疫苗制备和动物免疫试验奠定基础。     

长毛兔巴氏杆菌病诊断与防控

2013年5月从山东某大型长毛兔场患有以鼻炎和化脓性肺炎为主要临床特征的病免中分离到1株细菌,经细菌培养、染色镜检、生化试验、PCR鉴定、动物试验证实分离菌株为荚膜血清A型巴氏杆菌;药敏试验结果表明,分离菌株对替米考星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢噻呋钠、阿莫西林等药物敏感;通过设计3个试验组:巴氏杆菌本场疫苗免疫试验组、恩诺沙星防治试验组、巴氏杆菌本场疫苗免疫与恩诺沙星联用试验组,每组500只长毛兔,连续观察30 d,结果发现巴氏杆菌本场疫苗免疫与恩诺沙星联用试验组对该病的防控取得了较为理想的防治效果.