禽流感油乳佐剂疫苗质量快速检测方法的建立

通过对低温冻融法、研磨法、稀释高速捣碎法、95%乙醇法及三氯甲烷法破乳效果比较,确定三氯甲烷为油乳剂疫苗的破乳剂.将不同抗原含量的H9和H5亚型灭活与非灭活疫苗破乳后分离上层水相,采用红细胞凝集(HA)试验,测定其HA价,结果发现脱乳后上层水相与未做成油乳疫苗并做相应稀释的原液的HA价下降1～3个滴度,且将不同稀释度制备H5亚型疫苗经脱乳处理后上层水相的HA价与荧光定量PCR结果基本一致.所建立的禽流感油乳剂疫苗质量的检测方法具有快速、经济、简便,尤其适合于对大批量及基层应用.     

口蹄疫灭活疫苗蛋白质含量测定操作程序的确立

为优化用于口蹄疫灭活疫苗蛋白质含量测定的改良Lowry法,进而确立口蹄疫灭活疫苗蛋白质含量测定的操作程序,探索了有机溶剂破乳剂、酚红以及丙酮沉淀对测定结果影响。结果表明：样品中含酚红和有机溶剂均导致测定值较标准值高;有机溶剂破乳后,水相样经过丙酮沉淀测定值较标准值低;丙酮直接沉淀疫苗后测定蛋白质值与标准值符合度最高,丙酮沉淀回收率随蛋白浓度升高而升高,回收率在90％～100％之间。试验首次确立了改良Lowry法检测口蹄疫灭活疫苗中蛋白质含量的操作程序为丙酮直接沉淀疫苗后测定蛋白质浓度。并成功应用于口蹄疫灭活疫苗蛋白质含量的测定。     

不同剂型禽流感疫苗对蛋鸡免疫效果的分析与讨论

使用重组禽流感病毒灭活疫苗和禽流感-新城疫重组二联活疫苗对鸡禽流感进行免疫攻毒试验,通过血凝和血凝抑制(HI)试验技术检测机体内两种不同剂型疫苗的禽流感抗体水平,从中选出最佳免疫效果的疫苗。结果显示,禽流感病毒灭活疫苗优于禽流感-新城疫重组二联活疫苗,建议在防控禽流感时使用前者。     

不同剂型新城疫-禽流感二联灭活疫苗免疫SPF鸡后抗体水平对比试验

不同剂型的佐剂对疫苗的免疫效果有较大的影响,本试验旨在对比不同剂型佐剂的新城疫-禽流感(简称"新-流")二联灭活疫苗的免疫效果,从而为生产上选择最佳剂型佐剂应用于新城疫-禽流流感二联灭活疫苗提供依据。分别将油包水型、水包油型、水包油包水型佐剂与新城疫及禽流感灭活抗原乳化成不同剂型的新城疫-禽流感(H9亚型,HP株)二联灭活疫苗,将这三种不同剂型的新城疫-禽流感(H9亚型,HP株)二联灭活疫苗分别免疫一组7日龄SPF鸡。每羽颈部皮下注射0.2 m L,同时设一组未免7日龄SPF鸡作为对照组,各免疫组与对照组SPF鸡于免疫组免后6、10、15、21、28、35 d进行采血,检测新城疫与禽流感抗体水平。结果表明:免疫油包水型疫苗组SPF鸡免疫后新城疫与禽流感抗体上升最快,在免后10、15、21、28、35 d的新城疫与禽流感抗体也最高,其次是免疫水包油包水型的,而免疫水包油型疫苗组的SPF鸡新城疫与禽流感抗体上升最慢,而且在免后10、15、21、28、35 d的新城疫与禽流感抗体也最低。此外,从各免疫组可以看出,在免后6 d时新城疫抗体已开始产生,在1log2以下,而禽流感抗体仍未产生。可见免疫新-流二联苗后,新城疫抗体比禽流感抗体更早产生,油包水型新-流二联苗的免后抗体高于水包油包水及水包油型,而且能持续刺激机体产生高水平抗体,更具优势。     

对多种口蹄疫疫苗有效抗原（146S）、总蛋白、内毒素三者含量测定的比较研究

对市场上流行使用几种口蹄疫灭活疫苗进行有效146S抗原、总蛋白及内毒素含量测定,同时对疫苗破乳后的水相进行了SDS-PAGE分析。不同疫苗的质量差异极其显著,有效146S抗原含量从未检出至8.53μg/头剂;总蛋白含量从未检出至4 325μg/头剂;内毒素含量从0.55至15.65 EU/头剂。运用SDS-PAGE、Western bolt技术分析表明各种疫苗所含杂蛋白含量及有效抗原量差异较大。部分疫苗的有效146S抗原含量不足,非抗原蛋白含量较大,大多数国产疫苗146S含量与非抗原蛋白之比在0.3%以下,这是造成很多口蹄疫疫苗免疫过程产生的副作用及免疫失败的主要原因之一。     

口蹄疫基因工程疫苗不同佐剂水相配比优化研究

[目的]选择一种适合口蹄疫基因工程疫苗生产的佐剂。[方法 ]通过ISA 206和ISA201 VG油佐剂乳化后物理性状检验,参照现有口蹄疫灭活疫苗乳化工艺,选用ISA 206和ISA201 VG油佐剂,分别用4.6:5.4、1:1、5.4:4.6的水相和油相比例进行乳化,制备疫苗,于2~8℃保存15个月,分别于第3、6、9、12、15个月取样,进行疫苗物理性状检验。[结果 ]ISA201VG佐剂疫苗物理性状好于ISA 206油佐剂;疫苗水相和油相最佳配制比例为1:1;疫苗的外观、剂型、稳定性和黏度均符合产品的质量要求。[结论 ]ISA201VG佐剂可以作为口蹄疫基因工程疫苗佐剂使用。     

H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株灭活疫苗的研制

利用H7N9亚型重组禽流感病毒rGD76株进行灭活疫苗的研制,并对疫苗的免疫效果进行评价,为家禽H7N9亚型流感的防控提供科学数据及手段。将AIV-rGD76株用灭菌生理盐水作104倍稀释后,接种11日龄非免疫鸡胚,37℃孵育72h后收获感染鸡胚尿囊液,经甲醛灭活后,加矿物油佐剂乳化制成油乳剂灭活疫苗,对制备疫苗的性状、安全性、免疫效力等进行检验。结果显示,制备的3批重组禽流感病毒灭活疫苗(H7N9亚型,rGD76株)均为油包水型,黏度均在50cP以内,对3批疫苗取样,样品经3000r/min离心15min,管底无水相析出。安全性试验结果显示,将疫苗按1mL/只超剂量接种3周龄SPF鸡,试验鸡在观察期内全部健活,未出现局部或全身不良反应,表明疫苗对SPF鸡具有良好的安全性;免疫效力及攻毒保护试验结果显示,用疫苗按0.3mL/只的剂量免疫接种3周龄SPF鸡1次,免疫接种后21d试验鸡血清中rGD76株的HI抗体平均效价可达8log2以上,使用H7N9亚型高致病性禽流感病毒GD16株滴鼻接种0.2mL/只(含100LD50)对免疫鸡进行攻毒,疫苗对免疫鸡的保护率均为100%。在实验室条件下研制出重组禽流感病毒灭活疫苗(H7N9亚型,rGD76株),疫苗的各项指标均符合标准。     

高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗中146S抗原含量的疫苗前处理方法比较

为提高高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量的准确性、适用性和操作性,分别采用正戊醇、正丁醇和三氯甲烷对9批口蹄疫灭活疫苗进行破乳处理,对三种方法的破乳后水相得率和146S抗原含量的色谱检测结果进行比较。结果表明,破乳后水相得率分别为:正戊醇38%~49%,正丁醇42%~44%,三氯甲烷50%;9批疫苗的色谱结果均检测到146S特征峰,146S含量在0.7~12.5μg/mL,3次测定的相对标准偏差最大值为4.0%,9批疫苗不同前处理方法的检测结果均值具有统计学意义,三氯甲烷组与正戊醇组数据一致性强,正丁醇组测定值偏低。使用三氯甲烷对疫苗进行破乳,不仅操作简便快速,而且破乳水相得率稳定,是最优的破乳方法。实验进一步优化了口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量检测的高效体积排阻色谱法,为该方法的科学应用提供了数据支撑。     

高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗中146S抗原含量的疫苗破乳方法比较

为提高高效体积排阻色谱检测口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量的准确性、适用性和操作性,分别采用正戊醇、正丁醇和三氯甲烷对9批口蹄疫灭活疫苗进行破乳处理,对三种方法的破乳后水相得率和146S抗原含量的色谱检测结果进行比较。结果表明,破乳后水相得率分别为:正戊醇38%～49%,正丁醇42%～44%,三氯甲烷50%;9批疫苗的色谱结果均检测到146S特征峰,146S含量在0.7～12.5μg/mL,3次测定的相对标准偏差最大值为4.0%,9批疫苗不同前处理方法的检测结果均值具有统计学意义,三氯甲烷组与正戊醇组数据一致性强,正丁醇组测定值偏低。使用三氯甲烷对疫苗进行破乳,不仅操作简便快速,而且破乳水相得率稳定,是最优的破乳方法。实验进一步优化了口蹄疫灭活疫苗146S抗原含量检测的高效体积排阻色谱法,为该方法的科学应用提供了数据支撑。     

鸭病毒性肝炎防治的研究

目的：为防制鸭病毒性肝炎，减少雏鸭的死亡，研制出用于防制该病的油佐剂灭活疫苗。方法：用白油、司本-80、硬脂酸铝作为油相，吐温-80和收获的鸡胚尿囊液作为水相制出油包水型油佐剂灭活疫苗。结果：经试验该油佐剂灭活疫苗安全性可靠，接种后未见异常反应，免疫14d后保护率可达100％。结论：本试验中制得的疫苗具有粘度低、易于注射、乳化完全、稳定性好的优点，便于生产单位应用。     

口蹄疫病毒灭活疫苗中VP1基因RNA抽提方法的建立

本试验提取疫苗种毒、BEI灭活病毒和白油乳化灭活疫苗病毒中的RNA,并就VP1基因进行了RT-PCR扩增、核酸序列测定和序列比对分析。结果显示,3种来源的VP1基因片段长度均为813 bp,与预期的目标相符,核苷酸序列显示3种方法处理的病毒VP1同源性为100%。说明灭活剂BEI和乳化工艺没有全部破坏口蹄疫病毒VP1基因核酸,为检测疫苗毒株的核酸序列建立了一种方法。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗(YZ株)的制备及对仔猪免疫效力的评价

运用不同佐剂,并配合不同剂型,制备猪圆环病毒2型(PCV2)灭活疫苗(YZ株),然后评价各疫苗对仔猪的免疫效力。制备的灭活疫苗包括:用10号白油制备油包水(W/O)剂型疫苗;用Montanide~(TM)ISA 206 VG佐剂制备水包油包水(W/O/W)剂型疫苗;分别用Montanide~(TM) ISA 15A VG和ISA 35 VG佐剂,制备水包油剂型(O/W)剂型疫苗;用Montanide~(TM) IMS 251C VG佐剂,制备水(W)剂型疫苗。除白油组外,其余4组疫苗安全性较好。5组疫苗免疫效力试验表明,ISA 206 VG(W/O/W)疫苗组首免后2周和3周PCV-2荧光抗体水平显著高于白油(W/O)和IMS 251C VG(W)疫苗组(P0.05);攻毒后猪血清中病毒PCR检测,ISA 206 VG(W/O/W)疫苗组14 d均为阴性,其他免疫组21~28 d转为阴性;猪淋巴结免疫组化检测,ISA 206 VG(W/O/W)、ISA 15A VG(O/W)疫苗组均未出现PCV-2阳性,且该两组中仔猪均未出现连续2 d以上的高热症状。以上结果表明,ISA 206 VG(W/O/W)PCV2灭活疫苗(YZ株)对仔猪具有较好的免疫保护效力,可进行后续的临床扩大试验。     

H9亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护研究

为评价H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗对流行毒株的免疫保护效果,将禽流感病毒HF株灭活疫苗和商品化鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗分别以0.3 mL/只接种21日龄SPF鸡,3周后采血测定HI抗体效价,并用2018年-2019年分离的4株H9亚型禽流感病毒分别进行攻毒。结果显示,免疫后21 d, HF株灭活疫苗免疫组HI抗体效价达到9.1 log2以上,商品化疫苗HI抗体效价几何平均值则为6.3 log2以内。4株H9亚型禽流感病毒流行毒株以10~(7.0)EID_(50)的剂量静脉攻毒后,HF株灭活疫苗免疫组可抵抗流行毒株的攻击,保护率为100%;而商品化疫苗对流行毒株的攻毒保护率仅为40%～60%。说明H9N2亚型禽流感病毒HF株灭活疫苗具有较强的免疫原性,能使免疫鸡抵抗流行毒株的攻击。     

有关禽流感免疫的几个问题

近年来,国外一些国家和地区,采取对家禽接种灭活疫苗而有效地预防了禽流感的发生。家禽接种禽流感疫苗是对禽流感的较为有效的预防方法,但并不等于接种禽流感疫苗后就万事大吉、平安无事了。现就有关禽流感免疫的几个问题,谈谈个人的一些看法。一、疫苗种类的选择由于禽流感病毒易于变异,因而使用弱毒疫苗是非常危险的,因为活病毒随时可变异而使毒力返强,因而接种活毒疫苗无疑是等于撒布禽流感强毒,是危险和不可取的。一些基因工程疫苗在实验室内有不同程度的免疫效果,但考虑到它的生物安全性,以及与由全颗粒病毒制成的灭活疫苗相比,其免疫…     

信息广场

<正> 为全面提高我国口蹄疫疫苗质量,保证动物防疫工作有效开展,农业部经研究对现行"牛口蹄疫O型灭活疫苗质量标准"进行了修改,新标准自2004年1月1日起实施。牛口蹄疫O型灭活疫苗质量标准本品系用口蹄疫O型牛源病毒接种BHK-21细胞培养,收获细胞培养物,经二乙烯亚胺(BEI)灭活后,加油佐剂混合乳化制成。用于预防牛O型口蹄疫。物理性状外观为乳白色或淡粉红色的粘滞性乳状液。剂型为双相油乳剂(W/O/W)。用一清洁吸管,吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面,应呈云雾状扩散。粘度用1ml吸管(出口内径为1.2mm)吸取25℃左右的疫苗1ml,令其垂直自然流出0.4ml,所需时间应在3～8秒之间。稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中,以3000r/min离心15分钟,水相析出不超过0.5ml。无菌检验按《中华人民共和国兽用生物制品     

温度对禽流感灭活原液血凝价的影响

本试验主要采用红细胞凝集试验（HA）测定不同温度下灭活后禽流感病毒血凝素抗原原液HA效价的变化,探索灭活禽流感抗原贮存的适宜温度与贮存期,为原液的储存提供最佳贮存温度。     

温度对禽流感灭活原液血凝价的影响

本试验主要采用红细胞凝集试验（HA）测定不同温度下灭活后禽流感病毒血凝素抗原原液HA效价的变化,探索灭活禽流感抗原贮存的适宜温度与贮存期,为原液的储存提供最佳贮存温度。     

新型多肽因子佐剂对鸡新城疫免疫力水平影响的研究

为了验证多肽因子具有增强机体免疫,提高机体免疫应答水平并具有填补疫苗免疫空白期,加快机体抗体产生的时间等作用,利用反复冻融超滤法对鸡脾脏及鸡法氏囊进行多肽的提取,并利用所提取的多肽作为佐剂制备灭活疫苗而进行一系列实验。结果表明,多肽因子与疫苗同时免疫及利用多肽因子代替灭活疫苗中水相组的HI比单独免疫疫苗组HI值提高1～2个滴度。     

禽流感H5N1亚型不同株抗原抗体相互检测相关性试验

禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）是禽流行性感冒（简称禽流感,Avian Influenza,AI）的病原。其中高致病性的H5N1亚型AIV可以造成鸡群的大批死亡,对家禽养殖业影响严重,并可引起人的感染和死亡。通过接种疫苗能有效地控制禽流感的传播,在禽流感疫苗免疫效力的评价过程中,监测免疫鸡血清抗体是最常用、最可行的方法。2009年农业部批准重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re-5株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-5株＋Re-4株）制造,2012年重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re-6株）及重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-6株＋Re-4株）取代以上两个产品,2014年,北方出现了新的7．2分支毒株,而禽流感Re-4株疫苗和Re-6株疫苗对这种新型流行株的保护效力并不佳。2014年4月11日,农业部发布“中华人民共和国农业部公告第2093号”,制定了重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re-7株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（Re-6株＋Re-7株）2种兽药产品制造及检验规程,全国将主要以Re-6与Re-7两种疫苗联合免疫为新的趋势。本试验分别用不同毒株的禽流感试验抗原与不同毒株禽流感疫苗免疫鸡的血清通过HI试验相互检测,对抗体效价进行分析,从而得出不同毒株的相关性。     

禽流感H5N1亚型不同株抗原抗体相互检测相关性试验

禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）是禽流行性感冒（简称禽流感,Avian Influenza,AI）的病原。其中高致病性的H5N1亚型AIV可以造成鸡群的大批死亡,对家禽养殖业影响严重,并可引起人的感染和死亡。通过接种疫苗能有效地控制禽流感的传播,在禽流感疫苗免疫效力的评价过程中,监测免疫鸡血清抗体是最常用、最可行的方法。2009年农业部批准重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re-5株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-5株+Re-4株）制造,2012年重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re-6株）及重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-6株+Re-4株）取代以上两个产品,2014年,北方出现了新的7.2分支毒株,而禽流感Re-4株疫苗和Re-6株疫苗对这种新型流行株的保护效力并不佳。2014年4月11日,农业部发布“中华人民共和国农业部公告第2093号”,制定了重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型, Re-7株）和重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（Re-6株+Re-7株）2种兽药产品制造及检验规程,全国将主要以Re-6与Re-7两种疫苗联合免疫为新的趋势。本试验分别用不同毒株的禽流感试验抗原与不同毒株禽流感疫苗免疫鸡的血清通过HI试验相互检测,对抗体效价进行分析,从而得出不同毒株的相关性。