猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的原核表达和纯化

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)是一种具有多种生物学活性的细胞因子。本试验根据GenBank发表的猪的GM-CSF基因序列设计特异性引物,对GM-CSF基因片段进行扩增,扩增后的PCR产物经酶切后克隆入pET-28a载体。重组质粒转化入大肠杆菌杆菌BL21中经IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果证明,重组蛋白获得了成功表达,并且主要以包涵体的形式存在。Western blot结果证明重组蛋白具有良好免疫反应性。以上结果为进一步应用重组GM-CSF作为血液干细胞动员剂提供了基础。     

猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达及其促淋巴细胞增殖活性测定

根据GenBank上公布的猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(pGM-CSF)基因序列(U67175.1)扩增该基因,克隆至pET30b载体,构建重组表达载体pET30b-pGM-CSF,并与分子伴侣辅助质粒pG-KJE8共同转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE分析,可见表达的目的蛋白大小约为23ku,主要以包涵体形式存在,且在分子伴侣的辅助下,增大了可溶性蛋白的表达量。经镍离子亲和层析纯化后,通过淋巴细胞增殖试验初步检测了pGM-CSF蛋白促进淋巴细胞增殖的活性。结果表明,猪GM-CSF具有明显的体外刺激淋巴细胞增殖的生物学活性,为进一步研究猪GM-CSF的生物学功能以及临床应用奠定了基础。     

LPS诱导肺泡巨噬细胞法对奶牛GM-CSF的克隆与序列分析

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colonyst imulating fac- tor,GM-CSF)主要由T细胞和巨噬细胞产生,能够诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体呈集落性生长(即形成集落).GM-CSF还具有种属特异性和造血,抗炎,增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能,增强巨噬细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用,对粒细胞和巨噬细胞有直接的趋化等作用.试验旨在应用RT-PCR技术扩增奶牛GM-CSF基因,为进一步了解奶牛的GM-CSF基因和获得重组蛋白打下基础.     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆、原核表达及生物活性鉴定

为了探讨粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在免疫中的作用,根据GenBank上发表的鸡GM-CSF基因序列设计特异引物,采用RT-PCR法对球虫免疫后的海蓝灰蛋鸡盲肠扁桃体中GM-CSF基因进行克隆和序列分析;设计GM-CSF原核表达引物,原核表达GM-CSF融合蛋白,通过菌体裂解,包涵体的洗涤、溶解、复性后,过Sepharose4B柱纯化融合蛋白,采用抗病毒试验和淋巴细胞增殖试验检测表达蛋白的生物活性。结果显示,从人工感染柔嫩艾美耳球虫的海蓝灰蛋鸡盲肠扁桃体中扩增到了435bp的DNA片段;序列分析表明其与GenBank中报道的鸡GM-CSF序列仅有1个碱基的差异,与哺乳动物的同源性在35.2%～45.4%;原核表达了海蓝灰蛋鸡GM-CSF,分离纯化的融合蛋白在抗病毒活性试验和淋巴细胞增殖试验中证明具有一定的生物学活性。     

非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白表达及鉴定

根据GenBank登录的非洲猪瘟病毒(ASFV) VP73基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因片段,克隆至pUC57载体中.设计1对引物,PCR扩增获得429 bp的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX-KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化至表达菌株BL21 (DM3)中,进行体外诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性.结果显示,成功构建表达重组载体pGEX-KG-VP73,对该重组载体进行诱导,有效表达了41 ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的17％,Western blot分析证实该蛋白具有良好反应原性.     

牛乳腺炎无乳链球菌Pgk基因抗原优势区原核表达产物的抗原性分析

为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。     

非洲猪瘟病毒VP73结构蛋白表达及鉴定

 
为获得可作为血清学诊断抗原的体外诱导表达ASFV VP73 结构蛋白,根据GenBank登录的ASFV 基因序列,人工合成VP73主要抗原表位区基因克隆至pUC57载体中,设计1对引物,PCR扩增获得429 nt的VP73基因片段;将VP73基因片段使用EcoRI和SalI酶切后亚克隆至表达载体pGEX KG,经PCR、酶切、测序鉴定挑选阳性克隆,转化进表达菌株BL21(DM3)中进行体外诱导表达,SDS PAGE和Western blot分析蛋白表达及其活性。结果显示,成功构建表达重组载体pGEX KG VP73,且诱导有效表达了41Ku重组蛋白,表达量约占菌体总蛋白的35％;Western blot分析表达该蛋白具有良好的表达活性。试验为建立无感染性、快速、敏感的血清学诊断方法奠定了一定基础。     

猪巨细胞病毒gB蛋白抗原表位富集区的表达和抗原性的分析

为表达猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因,本研究根据GenBank登录的PCMV gB基因序列设计1对引物,以感染PCMV猪肺细胞总DNA为模板,采用PCR扩增得到gB基因片段,克隆于pMD-18T并进行核苷酸序列测定。利用DNAStar分析gB蛋白的抗原表位,选择抗原表位富集的2个基因片段(命名为PCMVgB1和PCMVgB2)分别克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒并转化Rosetta(DE3)宿主菌。结果显示:扩增的gB基因与GenBank登录的PCMV gB基因的核苷酸同源性在97.6%～98.9%之间,推导的氨基酸同源性在97%～98.6%之间。经IPTG诱导的含pET-gB1和pET-gB2重组质粒的宿主菌可表达重组gB1和gB2蛋白,SDS-PAGE显示分子量约为62ku和36ku。Western blot和间接ELISA结果表明,重组gB1和gB2蛋白均具有反应原性。     

猪白细胞介素-4基因的克隆与表达

利用RT-PCR技术,从被刺激诱导的PBMC中克隆IL-4基因,序列分析表明:克隆的猪IL-4基因序列与GenBank上登录的IL-4基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99%和97.8%.然后用表达型引物从T载体上扩增IL-4基因,双酶切PCR产物后与表达载体pGEX连接,构建重组表达质粒pGEX-IL-4,用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出38 ku融合蛋白,占菌体总蛋白的30%以上,并且以包涵体的形式存在,这为猪重组IL-4规模化生产和疫苗佐剂的研制奠定了基础.     

牛抗精子抗体11E基因的原核表达及其活性研究

抗精子抗体11被认为在雄性生殖道的先天免疫及生殖方面起着重要的作用,牛抗精子抗体11E(SPAG11E)主要存在睾丸、附睾等生殖道中。本实验根据GenBank中牛SPAG11E基因序列(登录号:DQ838983.1)设计特异性引物,提取牛睾丸组织总RNA,经RT-PCR获得SPAG11E基因序列,构建原核表达载体,并转入BL21(DE3),利用IPTG诱导表达,同时检测了重组蛋白体外抑菌活性。结果显示,成功扩增了牛SPAG11E基因的CDS序列,其与GenBank公布序列相一致;正确构建了原核表达载体pET-32a(+)-SPAG11E,最佳表达条件为IPTG终浓度1.0mmol/L、诱导时间4h;重组蛋白对检测的6种菌没有明显的抑菌作用。