中国美利奴羊TLR2基因多态性及其与布鲁氏菌病的相关性分析

试验旨在研究Toll样受体2(Toll-like receptor,TLR2)基因的多态性及其与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性的相关性。利用生物信息学方法对NCBI上公布的绵羊TLR2基因序列进行比对,选出多态位点丰富的片段进行扩增,运用PCR-SSCP的方法对206个中国美利奴布鲁氏菌病阴性样本和80个中国美利奴羊布鲁氏菌病阳性样本进行TLR2基因的多态性检测,然后对不同等位基因的PCR产物进行测序,确定该基因的多态性位点,经卡方检验分析每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,利用生物信息学软件分析RNA二级结构及蛋白质的二级结构。结果表明,在279bp的序列中共检测到3个SNPs,分别为:C1731T、G1737C和G1749T,均未引起对应氨基酸的改变,属于无义突变。这些位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及基因型频率均不存在显著差异(P0.05)。各突变位点均能引起RNA二级结构和最小自由能的改变,而蛋白质的二级结构均未改变。由此得出,中国美利奴羊TLR2基因的3个SNPs位点(C1731T、G1737C和G1749T)与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性无相关性。     

中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2遗传多态性与布鲁氏菌病易感性的关联分析

本试验采用PCR-SSCP方法对148只布鲁氏菌阴性和60只布鲁氏菌阳性中国美利奴羊白细胞表面抗原DQB1(OLA-DQB1)基因exon 2单核苷酸多态性(SNPs)进行了检测,之后挑选不同等位基因进行PCR产物测序,旨在确定该基因的多态性位点,并对每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率进行统计分析,从而分析其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性.测序结果表明,在270 bp的序列内共检测到43个SNPs,其中G196A位点的等位基因频率在病例组和对照组中的分布存在极显著差异(P< 0.01),其基因型频率存在显著差异(P< 0.05);C211T位点的等位基因频率在病例组和对照组中存在显著差异(P< 0.05).由此表明,OLA-DQB1基因exon 2多态性与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性呈显著相关.     

中国美利奴羊eNOS基因exon8多态性及其与布鲁氏菌病易感性相关性分析

本试验旨在研究内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因exon8多态性与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性的相关性。利用生物信息学方法对人和中国美利奴羊eNOS基因exon8序列进行比对,并对NCBI SNP数据库上人eNOS基因exon8多态性进行了统计分析。通过PCR-SSCP对101只中国美利奴羊阴性样本和61只中国美利奴羊阳性样本eNOS基因exon8的多态性进行检测,然后对不同等位基因进行PCR产物测序,旨在确定该基因exon8多态性位点,并对SNP位点的等位基因频率、基因型频率进行统计分析。在eNOS基因exon8序列142 bp处检测到一个新的SNP位点(ss974768653:A142G),该位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及各基因型间不存在显著差异性(P >0.05)。eNOS基因exon8 A142G多态性位点与中国美利奴羊布鲁氏菌病易感性可能无相关性。     

哈萨克羊DQB2基因外显子2多态性及遗传变异分析

试验旨在研究DQB2基因外显子2多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。通过PCR-SSCP技术对146只布鲁氏菌阴性哈萨克羊血液样本和28只布鲁氏菌阳性哈萨克羊血液样本中的白细胞表面抗原DQB2基因外显子2的多态性进行研究,挑取不同的等位基因进行克隆测序,经卡方检验分析每个SNP位点的基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,应用生物信息学软件分析与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性相关的不同等位基因的mRNA二级结构及蛋白质的二级结构、三级结构和抗原表位。结果发现,在270 bp的外显子2序列中共检测到33个SNPs,其中C9G、A180G位点的基因频率在病例组和对照组中的分布具有极显著性差异（P<0.01）,其基因型频率在病例组和对照组中存在显著差异（P<0.05）;A13T、C133G位点的基因频率在病例组和对照组中存在显著差异（P<0.05）;进一步分析发现,A180G突变位点的最小自由能最低,其mRNA二级结构最稳定;A13T和C133G 2个突变位点均引起mRNA二级结构及蛋白质二级结构、三级结构和抗原表位的改变。本试验结果表明DQB2基因外显子2多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性呈显著相关。     

哈萨克羊DRB1基因外显子3多态性及生物信息学分析

试验旨在研究白细胞表面抗原DRB1基因外显子3多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。运用混合DNA池结合PCR产物直接测序方法,对哈萨克羊DRB1基因外显子3进行多态性分析,经卡方检验分析每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,利用生物信息学分析软件对PCR扩增所获序列进行RNA二级结构及蛋白质的二级结构和抗原表位分析。结果表明,在282bp的外显子3序列中共检测到7个SNPs,分别为:T10C、C119T(Trp→Arg)、G215C(Gln→Glu)、A238G、T245G(Ser→Ala)、G256A、C259T,这些位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及各基因型间不存在显著性差异(P0.05);进一步分析发现,各突变位点均引起RNA二级结构和最小自由能的改变,各错义突变位点均未引起蛋白质二级结构和抗原表位的改变。由此得出,DRB1基因外显子3的7个SNPs位点(T10C、C119T、G215C、A238G、T245G、G256A和C259T)与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性无相关性。     

哈萨克羊DRB1基因外显子3多态性及生物信息学分析

试验旨在研究白细胞表面抗原DRB1基因外显子3多态性与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。运用混合DNA池结合PCR产物直接测序方法,对哈萨克羊DRB1基因外显子3进行多态性分析,经卡方检验分析每个SNP位点的等位基因频率、基因型频率及其多态性与布鲁氏菌病易感性的相关性,利用生物信息学分析软件对PCR扩增所获序列进行RNA二级结构及蛋白质的二级结构和抗原表位分析。结果表明,在282 bp的外显子3序列中共检测到7个SNPs,分别为：T10C、C119T（Trp→Arg）、G215C（Gln→Glu）、A238G、T245G（Ser→Ala）、G256A、C259T,这些位点在病例组和对照组之间的等位基因频率及各基因型间不存在显著性差异（P > 0.05）;进一步分析发现,各突变位点均引起RNA二级结构和最小自由能的改变,各错义突变位点均未引起蛋白质二级结构和抗原表位的改变。由此得出,DRB1基因外显子3的7个SNPs位点（T10C、C119T、G215C、A238G、T245G、G256A和C259T）与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性无相关性。     

哈萨克羊iNOS基因多态性与布鲁氏菌病的相关性分析

试验旨在探讨哈萨克羊诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因多态性与布鲁氏菌病的相关性。使用虎红平板凝集试验（RBPT）方法对231只哈萨克羊血清进行布鲁氏菌病血清学检测,参考GenBank中绵羊iNOS基因序列,针对其第6、7、8外显子及其邻近内含子片段设计引物,利用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对231只哈萨克羊的iNOS基因进行多态性检测,分析其SNPs与哈萨克羊布鲁氏菌病易感性的相关性。结果表明,67只哈萨克羊为布鲁氏菌感染阳性,阳性检出率为29.00%。在哈萨克羊iNOS基因的外显子6和8片段上未检测到多态位点,在外显子7片段上检测出F7-T18054C和F7-C18084T 2个多态位点,在F7-T18054C多态位点上检测到3种基因型（TC、TT、CC）,优势等位基因和基因型分别是C型和CT型,其等位基因频率和基因型频率分别是0.660和0.446。在F7-C18084T多态位点上检测到2种基因型（CT、CC）,优势等位基因频率和基因型分别是C和CC型,其等位基因和基因型频率分别是0.946和0.892。F7-C18084T属于低度多态（PIC<0.25）,F7-T18054C属于中度多态（0.25 < PIC < 0.5）。相关性分析表明,F7-T18054C和F7-C18084T多态位点与布鲁氏菌病易感性无显著相关性（P>0.05）。试验结果表明,哈萨克羊iNOS基因F7-T18054C和F7-C18084T多态位点与布鲁氏菌病易感性不存在相关性。     

不同绵羊品种FGF5基因的多态性分析

根据人和小鼠成纤维细胞生长因子5（FGFS）基因的同源序列设计引物对绵羊基因组进行PCR扩增，将扩增片段进行克隆和测序，并与人和小鼠的成纤维细胞生长因子5基因序列进行同源性比较，确定扩增的片段为绵羊的FGF5基因片段。采用PCR-SSCP技术分析了FGF5基因外显子在小尾寒羊、湖羊、藏羊、中国美利奴等4个绵羊品种的多态性。结果表明：FGF5基因在P1和P2引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性。经克隆测序分析，位于外显子1的引物1扩增产物存在G→T突变，该突变位点使编码的氨基酸发生A→S的改变；引物2扩增产物发生了碱基序列C→T的突变，这一突变位点没有引起编码氨基酸的改变，属于同义突变。对不同绵羊品种的基因型和基因频率统计结果表明，引物1扩增产物小尾寒羊、湖羊、藏羊以等位基因A为主，而中国美利奴羊则以等位基因B为主，且各群体均处于Hardy-Weinberg平衡；引物2扩增产物小尾寒羊、湖羊、中国美利奴羊均以等位基因E为主，而藏羊的基因型频率与其它品种有显著差异，中国美利奴羊在引物2位点的基因频率处于Hardy-Weinberg不平衡状态。     

中国美利奴羊内皮型一氧化氮合酶基因3个外显子多态性的PCR-SSCP鉴定

本试验旨在研究中国美利奴羊内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）基因第7、13、14外显子上的单核苷酸多态性（SNPs）和单氨基酸多态性（SAPs）。利用生物信息学方法对人、小鼠和中国美利奴羊eNOS基因上的第7、13、14外显子进行了相似性比较,并对GenBank SNP数据库上已公布的人和小鼠eNOS基因外显子多态性进行了统计分析,然后采用PCR-SSCP方法对120只中国美利奴羊eNOS基因的这3个外显子的扩增片段进行分析,通过分析发现在120只中国美利奴羊这3个外显子上并没有SNPs位点,说明中国美利奴羊eNOS基因上的这3个外显子区域相对保守。     

奶牛隐性乳房炎抗性相关基因多态性与体细胞评分关联分析

为了探讨中国荷斯坦奶牛隐性乳房炎相关基因NOD2c.4500、CXCR1+777、SPP1-1301、 TLR4+2021、CXCR2+777、 BRCA1c.46126单核苷酸多态性(SNPs)位点与体细胞评分的关联性，试验利用PCR-SSCP及Sanger测序技术对135头中国荷斯坦奶牛的6个SNPs位点进行基因分型，分析SNPs位点与中国荷斯坦奶牛体细胞评分的相关性，并运用多座位外显方差分析法(MPVA)对不同多基因聚合与奶牛体细胞数的相关性进行研究。结果表明：在6个SNPs位点上均检测到碱基突变，在NOD2c.4500 C>A、CXCR1+777 G>C、SPP1-1301 G>A、TLR4+2021 C>T位点上均检测到3种基因型，其中优势基因型分别为CA、CC、AA、CC,优势等位基因分别为A、G、A、C。在CXCR2+777 G>C、BRCA1c.46126 G>T位点上均检测到2种基因型，其中优势基因型均为GG,优势等位基因均为G。SPP1-1301 G>A、TLR4+2021 C>T位点均处于低度多态(PIC<0....     

Polymorphisms and Its Genetic Variation Analysis of DQB2 Gene Exon 2 in Kazakh Sheep

This study was aimed to investigate the association between the polymorphism of DQB2 gene exon 2 and the susceptibility to Kazakh sheep brucellosis. The DQB2 gene exon 2 of Kazakh sheep lymphocyte antigen was amplified by PCR-SSCP method from 146 healthy and 28 infected with Brucella Kazakh sheep, and the single nucleotide polymorphisms (SNP) was analyzed, then the different alleles were selected for cloning and sequencing. In order to analyze its correlation with brucellosis susceptibility, the differences in gene frequency and genotype frequency of each SNP locus were analyzed by Chi-square test. Bioinformatics softwares were used to analyze the secondary structure of mRNA, the secondary structure, tertiary structure and epitope of protein. The sequencing result showed that 33 SNPs were detected in 270 bp DNA sequence, the gene frequencies of C9G and A180G were extremely significantly different in case group and control group (P<0.01), and its genotype frequencies presented significantly difference (P<0.05). Similarly, A13T and C133G loci were significant difference in case group and control group (P<0.05). Further analysis result showed that the minimum free energy of the A180G mutation site was the lowest and its mRNA secondary structure was the most stable; Both A13T and C133G mutation sites caused the changes of mRNA secondary structure, protein secondary, tertiary structure and antigenic epitope of protein, respectively. The results showed that the polymorphism of DQB2 gene exon 2 might be significantly correlated with brucellosis susceptibility in Kazakh sheep.     

The Correlation Analysis between Chinese Merino Sheep OLA-DQB1 Gene Exon 2 Genetic Polymorphism and Brucellosis Susceptibility

The single nucleotide polymorphisms (SNPs) of ovine lymphocyte antigen DQB1 (OLA-DQB1) gene exon 2 was amplified by PCR-SSCP method from 148 healthy and 60 infected with Brucella Chinese Merino sheep and then PCR products of different alleles were sequenced to determine the polymorphism loci of the gene.The differences in gene frequency and genotype frequency of each SNP loci were analyzed statistically to analyze its correlation with brucellosis susceptibility.The sequencing result showed that 43 SNPs were detected in 270 bp DNA sequence,the gene frequencies of G196A allele had extremely significant difference in case and control samples (P< 0.01),and its genotype frequencies presented significant difference (P< 0.05).Similarly,C211T allele was significantly different in case and control samples (P< 0.05).The results showed that the polymorphism of OLA-DQB1 gene exon 2 might be a significant association gene with brucellosis susceptibility.     

The Polymorphisms of Chinese Merino Sheep eNOS Gene exon8 and its Association with Brucellosis Susceptibility

The association of Chinese Merino sheep eNOS gene exon8 polymorphisms with brucellosis susceptibility was studied in this research.The sequences of human and Chinese Merino sheep eNOS gene exon8 were aligned by the bioinformatics methods,and the polymorphisms of human eNOS gene in the NCBI SNP database were statistically analyzed.The polymorphisms of 101 Chinese Merino sheep negative samples and 61 Chinese Merino sheep positive samples were detected by PCR-SSCP method,and then the PCR products of different alleles were sequenced,aiming to determine exon8's polymorphism loci,and the allele frequency and genotype frequency of SNP loci were statistically analyzed.A novel SNP locus (ss974768653:A142G) was detected at the 142 bp of eNOS gene exon8,and the locus had no difference in allele frequency and each genotype between negative and positive groups (P >0.05).There might be no correlation between the A142G polymorphism locus of Chinese Merino sheep eNOS gene exon8 and brucellosis susceptibility.     

贵州半细毛羊ADAMTS1基因部分外显子多态性研究

为探索ADAMTS1基因在绵羊繁殖中的作用,本研究以贵州半细毛羊为试验对象构建DNA池,分别设计引物扩增第1、2、5-7和9外显子,研究ADAMTS1基因的遗传多态性.结果显示,ADAMTS1基因第6外显子有1个SNP (A255C),第9外显子有4个SNPs (A127G、G243T、G303T、A401G).生物信息学分析表明,SNPs位点对ADAMTS1基因RNA二级结构和蛋白结构均有一定影响.ADAMTS1基因可能影响贵州半细毛羊的繁殖性状.