用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10~(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感、特异的猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中CSFV E2基因保守区域序列,设计了一对特异性引物和一条特异性探针,以CSFV总RNA为反转录模板,经优化反应条件,建立CSFV实时荧光定量PCR检测方法,并对其进行了特异性、敏感性、重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了检测。结果表明,本研究建立的CSFV实时荧光定量PCR检测方法在10¹~10⁶拷贝/μL范围内有很好的线性关系,相关系数为0.999;CSFV细胞培养物出现阳性扩增信号,但ST正常细胞对照和其他8种病原对照未出现扩增,特异性良好;该方法重复性好、敏感性高,最低检测模板浓度为10拷贝/μL,并且CSFV的最低检测限为1 TCID₅₀/mL;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,与本课题组建立的CSFV Nested RT-PCR检测结果和克隆测序结果一致。本研究成功建立了CSFV实时荧光定量PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测。     

同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立

应用猪瘟病毒（CSFV）及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）特异性引物和TaqMan水解探针,建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT—PCR方法。该方法可检测到3．2TCID50的CSFV和1．8TCID50的北美洲型PRRSV,比常规PCR方法敏感性高50倍以上。用复合荧光定量RT—PCR方法对155份现地样品进行检测,结果73份为PRRSV阳性,16份为CSFV阳性,13份为CSFV和PRRSV混合感染,与常规RT—PCR的符合率高达99．4％。该复合荧光定量RT—PCR方法敏感、特异、重复性好。     

猪瘟病毒野毒株RT-LAMP可视化检测方法的建立

本研究旨在建立一种可视化检测猪瘟病毒(CSFV)野毒株的反转录.环介导等温扩增方法(RT-LAMP).根据CSFV的NS5B基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,利用Bsf DNA聚合酶,在62℃恒温条件下进行扩增,扩增产物中加入sYBR Green I染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果.该方法可检测出不同基因型的CSFV厂野毒株,其检出极限为2.5 TCID_(50)的CSFV,与实时荧光定量RT.PCR方法的敏感性相当;特异性试验表明,该方法对猪瘟免化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应;通过对126份不同样品进行检测比较,该方法与实时荧光定量RT-LAMP检测方法的符合率达100%.与引物.探针能量转移PCR方法的符合率为98.4%.该方法无需特殊仪器,是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法.     

猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗(C株)与野毒株的快速鉴别检测方法,本研究根据GenBank登录的CSFV C株与野毒株的E2基因序列差异,设计2对特异性引物,建立了同时检测C株与野毒株的双重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。应用该方法对CSFV野毒和疫苗株的最低检出量为10拷贝;检测牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型4种病毒均呈阴性;批内、批间重复试验的变异系数均低于3%。应用该方法检测从黑龙江省各地区猪场采集的600份样品,结果表明野毒株的阳性率为30.5%。该方法可应用于CSFV野毒株和C株的鉴别检测。     

多重荧光PCR鉴别诊断猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒

为了建立一种快速、灵敏、特异的能够同时检测猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒的多重荧光PCR方法。根据GenBank中公布的猪瘟病毒基因序列,设计一套特异性的引物和探针,对猪瘟病料提取RNA,经RT—PCR扩增后将产物回收,克隆至pMDl8-T构建pMDl8-T—CSFV阳性质粒;非洲猪瘟的目的片段序列采用化学合成,构建pMDl8-T—ASFV阳性质粒。以两种阳性质粒为模板时建立的多重荧光PCR方法做特异性、灵敏度和重复性试验,结果表明该方法可以将猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒同口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪水泡病病毒、猪圆环病毒2型区分开,灵敏度可以达到10拷贝的数量级．而且方法稳定。对2份已知猪瘟阳性血清样品和120份猪内脏、猪鼻腔拭子及血清样品检测后．发现对已知阳性样品的检测结果符合预期目标。未知样品检出猪瘟病毒3份阳性,未检出非洲猪瘟病毒阳性。     

猪源牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种荧光定量PCR检测方法,用于猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDVs)检测,同时能鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV).根据BVDVs与CSFV 5 '-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDVs 5′-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线.以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测.结果显示,该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20％～0.95％;应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7％.本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDVs、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测.     

两种荧光定量PCR方法检测猪瘟病毒的比较及应用

根据猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）5端非编码区保守区域,设计猪瘟病毒特异性的引物和探针,建立了基于SYBR Green和TaqMan探针的两种荧光定量PCR检测方法。灵敏性和特异性试验结果表明,两种方法能够特异性地检测出不同型的猪瘟病毒,而对同属的牛病毒性腹泻病病毒以及其它一些主要猪病病原检测结果均为阴性。两种方法对猪瘟病毒C株的检测下限均为101TCID50,均高于常规的套式PCR。用携带该基因片段的重组质粒为模板进行检测,SYBR Green方法的检测下限为3×100copies,比TaqMan探针方法更加灵敏（3×101copies）。应用建立的SYBR Green方法对2009年采集于浙江地区不同猪场的20份病猪样品进行CSFV检测,有8份样品为阳性,与套式PCR方法检测结果一致。进一步应用SYBR Green方法对不同感染阶段细胞内病毒RNA复制水平进行检测,与病毒滴度的结果基本一致。因此,本研究建立的SYBRGreen荧光定量PCR检测方法能够应用于组织和培养细胞中猪瘟病毒的检测。     

猪瘟病毒与猪圆环病毒2型混合感染的检测

对广西南宁市、贵港市、崇左市共5个规模化猪场送检病猪的组织器官样品(脾脏和淋巴结),应用已建立的检测猪瘟病毒(CSFV)的RT-PCR技术和检测圆环病毒2型(PCV-2)的PCR技术,快速准确地扩增出了CSFV和PCV-2特异的目的基因片段,从而证实为猪瘟病毒和猪圆环病毒2型混合感染。     

猪瘟病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、特异、灵敏的检测猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）巢式RT-PCR（nested RT-PCR）方法,本研究参照GenBank中公布的CSFV E2基因保守区域序列设计2对特异性引物,以CSFV总RNA为模板,优化反应条件,建立CSFV nested RT-PCR方法,对其进行特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的方法对35份临床疑似CSFV感染样品进行了应用检测,并对阳性PCR产物进行克隆测序鉴定。结果表明,本研究成功建立了CSFV nested RT-PCR检测方法,能够特异性地扩增CSFV,但对ST正常细胞对照和其他8种病原对照未扩增出任何条带;稳定性和重复性好;敏感性高,最低检测病毒含量为1 TCID₅₀;自35份疑似CSFV感染样品中检出19份阳性样品,PCR阳性产物克隆测序结果表明均为CSFV E2基因片段。本研究成功建立了CSFV nested RT-PCR检测方法,可用于CSFV的快速检测,为CSF的早期检测诊断提供了特异、灵敏的方法。