骆驼β-防御素caBD-1全长cDNA的扩增

获得全长cDNA 序列是研究基因结构、基因表达和基因功能的前提.我们根据已获得的骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的已知序列设计一条上游引物,反转录引物中的部分序列即3′末端序列.另外,采用反向嵌套PCR RACE法,根据caBD-1 cDNA的已知序列,设计一条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和两对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录成的cDNA 进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功的克隆了骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的5′末端序列.本研究扩增出的caBD-1 cDNA序列全322 bp,其中包含一个由192 bp组成的开放读码框(ORF),该ORF编码64个氨基酸残基的前原caBD-1肽.     

驯鹿β-防御素reBD-1全长cDNA的克隆及序列分析

为了获得驯鹿β-防御素reBD-1全长cDNA序列,根据已获得的reBD-1cDNA的已知序列设计1条序列特异性引物作为上游引物,反转录引物中的部分序列即3′接合器引物作为下游引物,克隆reBD-1cDNA的3′末端序列。另外,采用反向嵌套PCRRACE法,根据reBD-1cDNA的已知序列,设计1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将mRNA反转录成的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,克隆reBD-1cDNA的5′末端序列。结果成功的克隆出了reBD-1cDNA的3′和5′末端序列,从而得到372bp的reBD-1cDNA全序列,其中包含44bp5′非翻译区(UTR)、192bp的开放读码框(ORF)、终止密码子TAA、118bp的3′UTR和poly(A)15。reBD-1cDNA全序列的获得为进一步研究其基因结构、基因表达和基因功能奠定了基础。     

反向嵌套PCR技术扩增驯鹿Ghrelin cDNA 5′末端序列

为了研究Ghrelin在驯鹿生长发育过程中的作用和功能,以驯鹿为研究对象,采用反向嵌套PCR RACE技术原理,根据已知的序列设计1条5′末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将反转录成的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地扩增了驯鹿Ghrelin cDNA 5′末端序列。与锚定PCR相比,反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点,是一种非常有效的扩增cDNA 5′末端序列的方法。     

反向嵌套PCR技术扩增驯鹿Ghrelin cDNA 5'末端序列

为了研究Ghrelin在驯鹿生长发育过程中的作用和功能,以驯鹿为研究对象,采用反向嵌套PCR RACE技术原理,根据已知的序列设计1条5'末端磷酸化的特异性反转录引物和2对特异性反向嵌套PCR引物,首先进行反转录(RT),然后将反转录成的cDNA进行环化,最后进行反向嵌套巢式PCR,成功地扩增了驯鹿Ghrelin cDNA 5'末端序列.与锚定PCR相比,反向嵌套PCR法具有特异性强、扩增效率高等优点,是一种非常有效的扩增cDNA 5'末端序列的方法.     

驯鹿β-防御素-1 cDNA 3’末端的克隆及序列分析

为进一步研究驯鹿伊防御素-1（reBD-1）基因的分子结构，利用已克隆出的reBD-1部分片段，设计了1条特异性上游引物，并以反转录引物中的部分序列即3sites Adaptor Primer作为下游引物，采用3’RACE技术成功克隆了reBD-1 cDNA的3’末端序列。通过与已知reBD-1片段拼接，得到了192bp的完整开放读码框（ORF）、终止密码子TAA、118bp的3’非翻译区（3’UTR）以及poly（A）1S,其中ORF编码具有64个氨基酸残基的reBD-1前原肽。     

骆驼β-防御素caBD-1 cDNA的克隆及序列分析

β防御素是一类富含半胱氨酸的抗微生物多肽，主要表达在哺乳动物黏膜上皮内。我们发现了一种新的β-防御素-骆驼防β-御素-1(caBD-1)。从骆驼舌黏膜上皮组织中提取总RNA，采用RT-PCR技术扩增出caBD-1的cDNA，并重组到pBlueselect T载体，经限制性内切酶谱分析和DNA序列测定，证实所克隆的caBD-1的cDNA为β-防御素，因为该cDNA包含由192个碱基组成的开放读码框(ORF)，该ORF编码64个氨基酸残基的前原防御素，该前原防御素含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氮酸残基。骆驼β-防御素的发现对我们更好地理解骆驼黏膜防御机制有很大帮助。     

雌性骆驼生殖组织β-防御素-1基因的克隆及其组织表达量的检测

从雌性骆驼输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA，根据已发表的骆驼β-防御素-1基因的cDNA序列设计合成引物，采用RT—PCR扩增出了骆驼β-防御素-1基因；将扩增产物克隆于pBlueselect T载体后进行了序列分析。以伊肌动蛋白（pactin）基因作为内参，对扩增的β-防御素-1基因进行琼脂糖凝胶电泳后，应用凝胶成像分析系统，推断出了不同组织中β-防御素-1基因的表达量。结果，从雌性骆驼生殖各组织上皮均获得了203bp的β-防御素-1基因的扩增片段，且β-防御素-1基因在雌性骆驼生殖道各组织内的表达量不同。结果表明，β-防御素-1在雌性骆驼生殖组织的先天免疫中起重要作用。     

β-防御素caBD-1 mRNA在骆驼组织器官中的表达

根据已知的骆驼β-防御素caBD-1 cDNA序列设计了1对预计扩增产物为203bp的引物，通过RT—PCR检测骆驼的整个消化道黏膜、肝、胰腺、气管黏膜、肺、肾、膀胱黏膜、卵巢、子宫内膜、脾、淋巴结、心等器官内caBD-1 mRNA的表达。结果显示：caBD-1 mRNA在整个消化道、气管、膀胱、子宫等管状器官内的黏膜层有表达，而在实质性器官如心、肝、胰腺、肺、脾、淋巴结、卵巢、肾中无表达。提示，骆驼体内的这种内生性抗微生物肽有助于骆驼的黏膜宿主防御。     

RACE法扩增梅花鹿β-防御素-1(siBD-1)全长cDNA

为了获得梅花鹿β-防御素-1(sika deerβ-defensin-1,siBD-1)cDNA全序列,本试验以梅花鹿舌黏膜组织内提取的总RNA为模板,根据前期已获得的siBD-1cDNA的已知部分序列设计引物,采用5′-RACE和3′-RACE技术分别扩增5′-和3′-末端序列,将此扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明,成功克隆出长度约为172和299bp的siBD-1cDNA 5′-和3′-末端序列,从而得到418bp的siBD-1cDNA全序列(GenBank登录号:HM588696.1),其中包含89bp 5′-非翻译区(UTR)、192bp的开放阅读框(ORF)、终止密码子TAA、118bp的3′-UTR和Poly(A)16。同源性比对结果显示,siBD-1cDNA与水牛的肠防御素(BEBD)同源性最高,为90.6%,与牛(EBD、LAP、TAP、BNBD-4)、山羊(GBD-1、GBD-2)、驯鹿(reBD-1)、绵羊(sBD-1、sBD-2)和骆驼(caBD-1)的防御素cDNA的同源性较高,分别为83.2%、83.1%、87.3%、87.0%、87.5%、87.5%、84.4%、79.9%、77.1%和70.5%;与马(hoBD-1)和猪(pBD-1)的同源性较低,为60.3%和72.4%;而与人(hBD-2)的同源性最低,为16.0%。siBD-1成熟肽由38个氨基酸残基组成,其中包含9个带正电荷的氨基酸残基。     

RACE法扩增梅花鹿β-防御素-1(siBD-1)全长cDNA

为了获得梅花鹿β-防御素-1（sika deer β-defensin-1,siBD-1）cDNA全序列,本试验以梅花鹿舌黏膜组织内提取的总RNA为模板,根据前期已获得的siBD-1 cDNA的已知部分序列设计引物,采用5'-RACE和3'-RACE技术分别扩增5'-和3'-末端序列,将此扩增产物克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明,成功克隆出长度约为172和299 bp的siBD-1 cDNA 5'-和3'-末端序列,从而得到418 bp的siBD-1 cDNA全序列（GenBank登录号：HM588696.1）,其中包含89 bp 5'-非翻译区（UTR）、192 bp的开放阅读框（ORF）、终止密码子TAA、118 bp的3'-UTR和Poly（A）16。同源性比对结果显示,siBD-1 cDNA与水牛的肠防御素（BEBD）同源性最高,为90.6%,与牛（EBD、LAP、TAP、BNBD-4）、山羊（GBD-1、GBD-2）、驯鹿（reBD-1）、绵羊（sBD-1、sBD-2）和骆驼（caBD-1）的防御素cDNA的同源性较高,分别为83.2%、83.1%、87.3%、87.0%、87.5%、87.5%、84.4%、79.9%、77.1%和70.5%;与马（hoBD-1）和猪（pBD-1）的同源性较低,为60.3%和72.4%;而与人（hBD-2）的同源性最低,为16.0%。siBD-1成熟肽由38个氨基酸残基组成,其中包含9个带正电荷的氨基酸残基。     

蒙古绵羊β-防御素-1全长cDNA序列的扩增与分析

本研究以蒙古绵羊瘤胃为材料,提取瘤胃上皮组织总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出蒙古绵羊β-防御素-1(mgSBD-1)基因的核心片段序列,再应用5ˊ和3ˊ快速扩增cDNA末端(RACE)方法扩增蒙古绵羊β-御素-1基因的cDNA末端序列,最终获得mgSBD-1基因的全长cDNA序列.结果显示,该全长cDNA序列为325个碱基[不含poly(A)],5ˊ非翻译区为31个碱基,编码区(192个碱基)可编码64个氨基酸,3ˊ非翻译区为99个碱基[不含poly(A)].     

一种获取新基因的有效方法--cDNA末端快速扩增

cDNA末端快速扩增（rapid amplication of cDNA ends，RACE）又称为锚定PCR（anchored PCR），由Frohman等于1988年发明，是一种应用通用引物和特异引物从低丰度转录本中快速扩增已知表达序列标签（expressed sequencetags，ESTs）的5’和3’末端的简单而有效的方法。大多数ESTs分布于3’端，并且一般只有300～500bp，     

野生大豆DREB基因cDNA的克隆与分析

以野生大豆Glycine soja叶片总RNA为模板，根据其他双子叶植物DREBP/AP2结构域的保守氨基酸序列设计简并引物，通过降落和巢式PCR进行扩增，获得1条190 bp的cDNA片段。以此序列设计引物，采用RACE扩增3’和5’末端未知序列，最终克隆到野生大豆DREB全长基因（GsDREB）。该基因1 191 bp编码395个氨基酸，基因内部没有内含子。氨基酸分析表明，其N 末端具有核定位信号（nuclear localization signal, NLS），并具有由58个氨基酸编码的、能够与DNA结合的保守区域 DREBP/AP2结构域。通过多序列比对分析，该基因与拟南芥Arabidopsis thaliana DREB2C氨基酸序列相似性最高，推测其为DREB2亚家族的成员。     

一株诺如病毒的3’RACE扩增及基因序列分析

诺如病毒是严重危害人类健康的重要食源性病原。作者应用3’RACE(rapid amplification of cDNA 3’ends） 技术对一株诺如病毒分离株的基因组3’末端进行扩增，并对其核苷酸序列进行比较分析，从而可为该病的分子生物学检测提供阳性物质，并从分子水平上推测该病的来源。经过提取病毒总RNA、以3’RACE锚定引物进行反转录、用特异引物进行3’RACE，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明成功扩增了诺如病毒基因组约3282 bp的基因片段，测序及序列BLAST分析证实该分离株属GⅡ 4型，与日本分离株同源。3’RACE扩增序列为诺如病毒的实验室检测及深入研究奠定了基础。     

佳米驴β防御素aBD-1基因克隆及序列分析

为获得佳米驴β防御素-1(aBD-1)的全长cDNA序列,为开发其药用功能积累资料。从佳米驴舌黏膜上皮组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增出aBD-1(ass-βdefensin-1)cDNA的中间片段后,再采用RACE法,扩增佳米驴β防御素aBD-1的cDNA全序列。aBD-1 cDNA全序列长为360 bp,其中包含192 bp的开放阅读框,37 bp的5′非翻译区(5′UTR),102 bp的3′非翻译区(3′UTR)以及poly(A)26。在GenBank上注册号为EU265778,测序结果和序列生物信息学分析结果表明,其与马β防御素eBD-1、牛的β防御素TAP、绵羊的β防御素sBD-1、猪的β防御素pBD-1和人的β防御素hBD-2的同源性分别为92%、68%、75%、75%和68%。aBD-1全长cDNA是β防御素家族中的一个新基因。     

猪CstB基因3’侧翼序列的克隆研究

为了获得猪Cst B基因3’侧翼序列,试验以大白猪cDNA为模板,采用RACE克隆方法,根据GenBank上提供的猪外显子3序列设计引物。结果表明:猪Cst B基因3’侧翼序列长度为225 bp,并提交GenBank收录(GenBank登录号为EF483823)。     

丝羽乌骨鸡β-防御素基因的克隆和序列分析

用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术特异性地扩增到丝羽乌骨鸡β-防御素基因Gal-1(Gallinacin-1),Gal-1(a)(Gallinacin-1(a)),Gal-2(Gallinacin-2),Gal-4(Gallinacin-4)～Gal-13(Gallinacin-13)基因共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,并提交到GenBank,丝羽乌骨鸡β-防御素Gal-1,Gal-1(a),Gal-2,Gal-4～Gal-13基因的登录号为:DQ677632￣DQ677644。将丝羽乌骨鸡13种β-防御素Gal-1～Gal-13基因分别与GenBank中收录的防御素基因比对分析,其氨基酸序列的相似性均在95.5%～100%之间。利用DNAStar软件对所获得的13种丝羽乌骨鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果Gal-1、5、12在同一分支上,Gal-1(a)、4、8在同一分支上,Gal-1、2、9在同一分支,Gal-6、7在同一分支,Gal-13独在一分支上。     

海滨雀稗液泡膜H＋-PPase（PvVP1）5′端的克隆和序列分析

根据已公布液泡膜 H＋-PPase基因家族同源序列保守区设计简并引物，克隆出海滨雀稗中PvVP1基因的中间序列，然后用快速扩增cDNA末端（rapid amplification of cDNA end，RACE）方法，从海滨雀稗中克隆到PvVP15′cDNA序列。该序列ORF长1605 bp，编码535个氨基酸，其编码序列、氨基酸序列与玉米相应基因的同源性分别为93％和99％。     

蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素(sBD-1)的序列分析及组织表达

从蒙古绵羊输卵管、子宫、子宫颈、阴道组织中提取总RNA,根据GenBank中羊的β-防御素的cDNA序列设计合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了301bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析,确认该PCR产物为β-防御素。通过相同的RT-PCR反应体系和条件后,对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,以β-actin为参照,根据PCR产物的亮度推断不同组织中β-防御素的表达量。结果,蒙古绵羊雌性生殖道上皮各组织均有β-防御素表达,说明β-防御素在蒙古绵羊雌性生殖道的先天免疫中起重要作用。β-防御素的表达量在雌性生殖道各组织内不同,提示雌性生殖道各组织的防御功能强度不同。     

安徽三黄鸡β-防御素Gal-6cDNA基因片段的克隆与序列分析

根据基因库中鸡β-防御素Gal-6cDNA基因序列设计2对引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从安徽三黄鸡白细胞RNA中扩增了β-防御素Gal-6cDNA基因片段。得到了大小为250bp片段。将扩增产物纯化并克隆到PGEM-T-Easy载体上,转化感受态细胞DH-5α,经筛选获得重组质粒并测序,用P3/P4引物从重组质粒中扩增出成熟肽,大小约150个bp。测序后Blast分析表明,安徽三黄鸡序列与基因库上已发表的序列相差一个碱基,Gal-6多肽共有67个氨基酸组成,分别是20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片段、42个氨基酸的成熟肽。