玻璃化冷冻牛GV卵母细胞全基因组甲基化模式初探

旨在研究玻璃化冷冻对牛GV期卵母细胞全基因组甲基化的影响。本研究收集新鲜、玻璃化冷冻的牛GV卵母细胞，采用单细胞全基因组甲基化测序（ScWGBS）技术对新鲜、玻璃化法冷冻牛GV卵母细胞的全基因组甲基化水平进行检测，旨在揭示两者DNA甲基化模式的差异。结果表明，玻璃化冷冻不会对牛GV卵母细胞的全基因甲基化水平造成显著影响。基于基因本体（GO）和信号通路（KEGG）对140个差异甲基化区域（DMRs）进行分析，发现DMRs主要参与细胞发育、细胞骨架组织等功能，主要富集在PI3K-Akt信号通路、GnRH信号通路等，并筛选出与卵母细胞成熟（TSC2）、细胞骨架（NUDC）、细胞活力（MAFK）等相关的基因。上述结果，可为提高GV卵母细胞玻璃化冷冻效率奠定信息基础和研究方向。     

新鲜、玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚全基因组甲基化模式初探

旨在初步分析新鲜及玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚全基因组甲基化模式。本研究采用单细胞全基因组甲基化测序技术(scWGMS)检测新鲜、玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚全基因组甲基化水平和差异甲基化区域(DMR),探讨两者之间DNA甲基化水平上的差异。结果表明,新鲜卵母细胞体外受精囊胚的整体甲基化水平显著高于玻璃化冷冻卵母细胞体外受精囊胚的整体甲基化水平(P<0.05)。采用基因本体分析(GO)和相关信号通路(KEGG)对143个DMRs分析,发现生物学过程主要显著富集在新陈代谢、生长发育、细胞定位、细胞刺激反应等,通路主要富集在生长发育、核酸结合及组蛋白乙酰化上,并筛选出几个与之相关的候选基因(FARP2、PI4KA、FAM3D、NCOR2、ZNF827等)。本研究初步发现,玻璃化冷冻牛卵母细胞体外受精囊胚的全基因组甲基化水平显著降低,且DMR区域主要集中在ATP结合、生长发育及组蛋白乙酰化,为提高玻璃化冷冻卵母细胞体外受精囊胚质量提供信息参考。     

玻璃化冻存对蒙古驴卵母细胞甲基化及GFM1、MRPL15基因表达水平的影响

旨在探讨玻璃化冷冻对驴卵母细胞发育的影响。采集新鲜驴卵巢组织,将收集的卵母细胞分别按以下3种方式进行处理:直接冷冻(T1组)、冷冻复苏+成熟处理20h(T2组)、冷冻复苏+成熟处理40h(T3组);同时,取新鲜的GV期卵母细胞,分别设置相应的对照处理方式:新鲜细胞不进行成熟处理(C1组)、成熟处理20h(C2组),成熟处理40h(C3组)。各处理组细胞经转录组测序后,采用Trimmomatic(v0.36)软件对原始数据进行过滤,并对后续数据进行分析。过滤后将原始数据与参考基因库比对,进行注释分析和甲基化位点识别,比较各处理组之间的甲基化水平。结果显示,T1、T2组甲基化水平分别大于C1、C2组,T3组甲基化水平小于C3组;各冷冻处理组卵母细胞的CpGs甲基化水平为T1组>T2组>T3组。共选择出总体差异基因1269个,玻璃化冷冻处理细胞与未冷冻处理细胞之间具有差异的基因确定为677个。GFM1与MRPL15基因甲基化差异最为显著,基因通路富集到线粒体延伸途径中,这是导致玻璃化冷冻后驴卵母细胞成熟率较低的因素。研究结果为确定卵母细胞冷冻最佳条件奠定了试验基础。     

不同性别大白猪肌肉全基因组高分辨率单碱基甲基化差异分析

旨在通过不同性别大白猪的全基因组高分辨率单碱基甲基化差异分析,检测差异甲基化区域(DMR)和差异甲基化基因(DMG),为进一步解析公母猪骨骼肌发育差异奠定基础。本研究采用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)技术分析了4头210日龄长白猪(公、母各半)背最长肌全基因组DNA的甲基化程度和差异甲基化区域,探讨性别间DNA甲基化水平的差异。结果表明,全基因组范围约有5%的胞嘧啶(C)发生了甲基化(mC);母猪和公猪的总体甲基化水平基本一致。共检测到1 629个DMRs和841个DMGs。母猪的DMRs平均甲基化水平明显高于公猪。通过基因本体分析(GO)和相关信号通路(KEGG)分析,共检测到171个GO条目和10个信号通路,显著富集在轴突导向、细胞连接、细胞粘附、ECM受体互作等相关过程中;筛选出5个与不同性别肌肉调节相关的候选基因。本研究绘制了不同性别大白猪的高分辨率单碱基全基因组甲基化图谱,为不同性别表观遗传研究以及肌肉发育和肉质相关候选基因的筛选提供了信息参考。     

玻璃化冷冻对哺乳动物MⅡ期卵母细胞表观遗传学的影响

玻璃化冷冻作为一种操作简单、成功率高的细胞保存方式具有诸多优点，广泛应用于农业、医学、生物等领域。但相较于新鲜卵母细胞，玻璃化冷冻后的卵母细胞仍存在许多问题，如玻璃化冷冻后的卵母细胞妊娠率和产活仔率低于新鲜的卵母细胞、基因表达异常等。表观遗传学是研究基因在核苷酸序列不发生改变的情况下基因表达的可遗传变化的一门学科。表观遗传修饰在不改变DNA序列的情况下使基因和环境之间产生相互作用。在体外胚胎生产过程中，外界环境因素会对表观遗传修饰造成影响。作者从表观遗传学方面综述了玻璃化冷冻对哺乳动物MⅡ期卵母细胞DNA和全基因组甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化、磷酸化及泛素化、基因印迹、microRNA的影响，以及玻璃化冷冻MⅡ卵母细胞后表观遗传修饰的改变对转录过程中基因的表达影响，为揭示并调控玻璃化冷冻卵母细胞后表观遗传修饰事件、进一步提高玻璃化冷冻后卵母细胞的质量提供参考。     

细胞松弛素B对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

本试验通过玻璃化冷冻前不同浓度细胞松弛素B(cytochalasin-B,CB)预处理来分析CB对牛GV期卵母细胞固体表面玻璃化(SSV)冷冻后发育潜力的影响。试验结果表明,玻璃化冷冻后,CB处理组和未处理组之间卵母细胞成熟率差异不显著(P>0.05),但均显著低于体外培养组。说明试验中所用CB浓度 (2.5、7.5、15、20和30 μg/mL)对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的改善作用不明显。     

基于全基因组差异甲基化分析鉴别影响苏姜猪体重的候选基因

本研究旨在分析不同体重苏姜猪的全基因组DNA甲基化差异，以期筛选出影响苏姜猪体重的差异甲基化基因（differentially methylated genes，DMGs）。利用全基因组重亚硫酸盐测序（whole genome bisulfite sequencing，WGBS）技术分析了3头180日龄高体重和3头180日龄低体重苏姜猪的全基因组DNA的甲基化程度、差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMRs）和DMGs，对DMGs进行GO和KEGG分析，鉴别影响苏姜猪体重的候选基因。结果显示，苏姜猪全基因组范围内胞嘧啶（C）的平均甲基化率为4.1%，胞嘧啶（C）甲基化平均98.41%发生在CG序列上，CG序列环境下外显子、内含子和3'UTR的甲基化水平高于启动子和5'UTR。本研究共检测出1 657个DMRs和575个DMGs，8号染色体上DMRs分布最多，88.89%的DMRs的长度在500 bp以内，62.78%的DMRs分布在远端基因间区，98个DMGs显著富集于TOR信号的负调控、碳水化合物衍生物分解代谢过程、脂肪细胞因子信号通路、FoxO信号通路等53个GO条目和29个信号通路，鉴别到5个与苏姜猪体重相关的候选基因：瘦素受体（leptin receptor，LEPR）基因、肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）基因、生肌因子6（myogenic factor 6，MYF6）基因、钙依赖性分泌激活因子2（calcium dependent secretion activator 2，CADPS2）基因和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）基因。本研究利用WGBS绘制了高、低体重组苏姜猪的全基因组DNA甲基化图谱，为深入研究苏姜猪体重差异的分子机制奠定了基础。     

玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

试验首次采用OPS法玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞(不带卵丘细胞,下同),同时尝试用EDFS30对小鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻,以研究GV期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先,利用MEM培养和MEM-腔前卵泡培养新鲜GV期卵母细胞,并把较好的培养方式用于冷冻后培养试验。2种培养方式培养24h后新鲜GV期卵母细胞成熟率无显著性差异;OPS法冷冻的GV期卵母细胞解冻后成熟率及体外受精后卵裂率与对照组差异不显著(P>0.05)。细管法冷冻卵巢组织的GV期卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01),其受精后未获得受精卵。结果表明:OPS法可有效地冷冻保存小鼠GV期卵母细胞,而细管法冷冻小鼠卵巢对GV期卵母细胞损伤较大。     

产蛋前期和产蛋高峰期鸡全基因组甲基化差异及其对肝脏转录组影响的研究

旨在通过对产蛋前期和产蛋高峰期鸡肝全基因组甲基化差异进行分析,解析基因组甲基化对不同发育阶段肝中基因表达差异的影响。本研究采用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术对产蛋前期（20周龄）和产蛋高峰期（30周龄,各3只DNA混池）卢氏绿壳蛋鸡肝全基因组的甲基化水平进行检测,并与已有的肝mRNA转录组数据进行整合分析,探讨基因组甲基化对不同生理阶段基因表达差异的影响。结果表明,全基因组范围约有4%的胞嘧啶（C）发生了甲基化（mC）;两个生理阶段的总体甲基化水平基本一致。共检测到670个差异甲基化区域（DMRs）和356个差异甲基化基因（DMGs）。基因本体（GO）和相关信号通路（KEGG）分析发现,超甲基化DMGs显著富集在发育的正向调控、细胞形态改变的调控、VEGF信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控、粘着斑及间隙连接等相关过程,低甲基化DMGs显著富集在胚胎消化道形态的发生、间充质细胞增殖的正向调控、淀粉和蔗糖代谢及Wnt信号通路等相关过程。基因不同功能区域甲基化水平与基因表达水平有关,启动子（promoter）及基因体（gene body）区域甲基化水平与基因表达水平呈显著负相关,其他区域（内含子、3'UTR）的甲基化水平与基因的表达水平无明显关系。其中,与肝脂质代谢相关的候选基因RASD1、HAO1、UBE2O、MSRB3受甲基化调控。本研究绘制了不同生理时期卢氏绿壳蛋鸡全基因组甲基化图谱,结合mRNA转录组数据阐述了DNA甲基化在基因表达方面的调控作用,并鉴定出了不同生理时期受甲基化调控的基因,为深入研究表观遗传调控在不同生理时期蛋鸡肝代谢中的作用机制提供参考。     

牛GV期卵母细胞冷冻保存后发育潜力的研究

二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)和甘油(GL)4种冷冻保护剂程序化冷冻牛GV期卵母细胞的结果表明,EG和PROH的保护效果比GL和DMSO好。4种不同冷冻方法冷冻保存牛GV期卵母细胞,比较解冻后卵母细胞的体外成熟率、受精后卵裂率。结果表明,在程序化冷冻法与细管玻璃化法(Straw)之间的差异不显著(P>0.05),在开放式拉管法(OPS)与毛细玻管法(GMP)之间的差异不显著(P>0.05);但OPS和GMP与程序化冷冻法和Straw之间的差异极显著(P<0.01)。玻璃化冷冻效果优于程序化冷冻。说明GMP和OPS玻璃化冷冻优于Straw玻璃化冷冻。说明可以采用GMP方法冷冻保存牛GV期卵母细胞。     

玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响

为详细了解玻璃化冷冻对绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的影响,分别玻璃化冷冻GV期和IVM 期(18、24 h)绵羊卵母细胞,解冻后进行体外培养.GV期和IVM期卵母细胞经过冷冻-解冻后,卵裂率(10.37％、23.17％、33.07％)均极显著低于对照组(82.96％,P＜0.01),且冷冻-解冻后的GV期卵母细胞卵裂率极显著低于冷冻-解冻后的IVM期卵母细胞(P＜0.01).本试验利用荧光实时定量PCR技术检测4种母源基因:Gdf9(生长分化因子-9)、Zar1(合子阻泄因子)、Mater(胚胎必要的母体抗原)、Dnmt1(DNA甲基化转移酶1)在不同处理后的绵羊卵母细胞中的mRNA含量.结果表明,4个基因的mRNA在GV期的表达量均高于IVM期的卵母细胞(P＜0.01);经玻璃化冷冻处理后,4个基因的mRNA表达量升高,其中GV期含量最高(P＜0.01).结果提示,绵羊GV或IVM期卵母细胞玻璃化冷冻导致母源基因mRNA表达量升高,可能会对胚胎发育产生负面影响.     

滩羊和湖羊背最长肌全基因组甲基化差异分析

本研究旨在通过不同品种绵羊背最长肌的全基因组甲基化差异分析,鉴定差异甲基化区域（DMR）和差异甲基化基因（DMG）,为解析绵羊骨骼肌发育差异奠定基础。采用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术开展了周岁龄滩羊、湖羊和滩湖F2代背最长肌全基因组DNA的甲基化水平检测和差异甲基化区域分析,探讨品种间DNA甲基化水平的差异。结果显示,全基因组范围内滩羊、湖羊和滩湖F2代胞嘧啶（C）甲基化（mC）率分别为3.55%、3.18%和3.56%,3个群体的甲基化水平基本一致。对滩羊和湖羊的甲基化水平进行比较,在不同序列环境下共检测到97 731个DMRs和10 784个DMGs。在CG、CHH、CHG序列环境下3个群体甲基化水平无显著差异。对DMGs通过基因本体（GO）和相关信号通路（KEGG）分析,共检测到419个GO条目和20个信号通路,显著富集在细胞过程、细胞组分、结合、长期抑制等相关条目中。筛选出5个与肌肉调控有关的候选基因ACTA2、ROCK1、CALD1、MYH3、MYH10。本研究绘制了滩羊、湖羊和滩湖F2代全基因组甲基化图谱,为表观遗传调控肌肉发育研究和肉质候选基因的筛选提供理论参考。     

鸡繁殖性能近交衰退相关CpG岛差异甲基化基因的筛选

鸡繁殖性能近交衰退是地方鸡遗传资源活体保种过程中面临的重要问题之一,本研究旨在探讨全基因组CpG岛（CpG island,CGI）区DNA甲基化在鸡繁殖性能近交衰退中的作用。分别从狼山鸡高近交组和低近交组中各选取健康母鸡3只,即试验分2个组,每组3个重复,然后采用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术,检测分析两组个体性腺轴组织（包括卵巢和下丘脑）全基因组DNA甲基化差异,筛选差异甲基化区域（DMRs）,并对CpG岛区差异甲基化基因进行功能注释和富集分析。结果表明,狼山鸡高近交组和低近交组比较,其卵巢和下丘脑基因组整体甲基化水平均不存在显著差异（P>0.05）;高、低近交组间差异甲基化区域检测发现,下丘脑和卵巢中分别检测到5 948和4 593个差异甲基化区域,其中1 798和995个差异甲基化区域位于基因组CpG岛区,分别注释到1 020和552个基因;下丘脑中,这些CpG岛区差异甲基化基因显著富集在信号转导、神经系统发育、生殖系统发育和卵母细胞成熟调控等繁殖相关的GO条目,以及转化生长因子β信号通路、乙型肝炎、脂肪酸代谢、胰岛素信号通路等19条KEGG信号通路（P<0.05）;卵巢中,CpG岛区差异甲基化基因显著富集于12条信号通路（P<0.05）,包括慢性骨髓白血病、流感A、精氨酸和脯氨酸代谢、粘着连接等,一些与卵子发育和性激素分泌相关的信号通路也被富集到,如黄体酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、GnRH信号通路、雌激素信号通路等,其中包含CDC27、ADCY8、AKT3等10个差异甲基化基因。因此,本研究在狼山鸡高、低近交组间检测到了大量差异甲基化区域,并发现大量差异甲基化基因与繁殖性状相关,推测这些基因CpG岛区DNA甲基化可能在狼山鸡繁殖性能近交衰退调控中发挥重要作用,研究结果为进一步深入探索鸡繁殖性能近交衰退调控机制奠定了基础,为物种资源保护和家禽育种工作提供了理论参考依据。     

毛细玻管玻璃化冷冻法冷冻保存牛卵母细胞的研究

为了探讨毛细玻管玻璃化冷冻法(GMP)对牛卵母细胞冷冻效果的影响,试验采用毛细玻管玻璃化冷冻法冷冻不同发育阶段的牛卵母细胞,并且对不同预处理方式和玻璃化时间对玻璃化冷冻牛卵母细胞解冻后形态及体外受精卵裂率的影响进行了比较.结果表明:采用毛细玻管玻璃化冷冻法冷冻GV期和体外培养6 h、18 h、22 h各发育阶段的卵母细胞,解冻后体外受精后卵裂率分别是36.67%、40.98%、41.27%、52.38%,前三者之间差异不显著(P>0.05),前三者与培养22 h卵母细胞(52.38%)和对照细胞(68.42%)差异极显著(P<0.01);采用不同浓度的稀溶液预处理卵母细胞,3%乙二醇稀溶液预处理玻璃化前牛卵母细胞可分别获得较高的卵裂率(36.96%);卵母细胞在玻璃化溶液中暴露时间越长受到损伤越严重,暴露30 s能获得最好的玻璃化冷冻效果.     

钌红对玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体Ca~(2+)的调控研究

玻璃化冷冻会严重损伤哺乳动物卵母细胞的线粒体功能,进而极大地限制了其解冻后的发育能力。为此,本试验设置3个钌红(RR)处理组,即牛卵母细胞用含0.5、1、2μmol/L RR的玻璃化冷冻液进行冷冻,解冻后放入含0.5、1、2μmol/L RR的体外成熟液中继续培养0.5h,同时,新鲜卵母细胞一部分不进行冷冻,一部分用不含RR的冷冻液进行玻璃化冷冻,分别作为新鲜对照组和玻璃化冷冻对照组,然后共检测5组牛卵母细胞线粒体Ca~(2+)水平、ATP含量及孤雌激活后胚胎的发育能力,进而研究RR对玻璃化冷冻牛卵母细胞线粒体Ca~(2+)水平的调控作用。结果显示:(1)玻璃化冷冻显著提高了牛卵母细胞中线粒体Ca~(2+)水平(P0.05),而2μmol/L RR处理组线粒体Ca~(2+)水平显著低于冷冻对照组(P0.05),但与新鲜组相比无显著差异(P0.05);(2)玻璃化冷冻显著降低了牛卵母细胞中ATP含量(P0.05),2μmol/L RR处理组卵母细胞中ATP含量显著高于冷冻对照组及0.5、1μmol/L RR处理组(P0.05);(3)玻璃化冷冻对照组卵裂率、囊胚率显著低于新鲜对照组(P0.05),1μmol/L处理组卵裂率、囊胚率与新鲜对照组相比无显著差异(P0.05)。综上所述,RR处理能显著抑制解冻后牛卵母细胞线粒体Ca~(2+)流入,保护线粒体功能,提高其发育能力。本试验结果为正向调控玻璃化冷冻卵母细胞线粒体Ca~(2+)水平,进而提高其发育能力,促进玻璃化冷冻卵母细胞的广泛应用提供了参考依据。     

采用dCas9-SunTag-DNMT3A技术调控玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平

旨在探究dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统对玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平及胚胎发育能力的影响,为冷冻卵母细胞/胚胎特定位点DNA甲基化的精确调控奠定基础。本研究将经过体外成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻,随后进行体外受精,将受精所得到的原核胚进行dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统的注射,统计并计算卵母细胞的发育情况;通过亚硫酸盐测序的方式检测IGF2R基因启动子的甲基化水平,并利用荧光定量PCR检测IGF2R及相关基因的表达水平。与冷冻组相比,注射不同浓度的dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统后,只有40 ng·μL^-1组显著地提高了玻璃化冷冻卵母细胞IVF后的发育能力(P＜0.05),20和60 ng·μL^-1组间差异不显著(P＞0.05),但40 ng·μL^-1组发育效果仍然显著低于新鲜对照组(P＜0.05);对检测冷冻组、新鲜组、40 ng·μL^-1组IGF2R基因启动子甲基化水平分析发现,40 ng·μL^-1组水平与新鲜组相似,显著高于冷冻组(P＜0.05);荧光定量试验结果显示,40 ng·μL^-1组IGF2R基因mRNA表达水平相较于冷冻组显著降低(P＜0.05),与新鲜组相似。注射40 ng·μL^-1的dCas9-SunTag-DNMT3A甲基化编辑系统能够通过有效升高IGF2R基因启动子甲基化水平(P＜0.05)及显著降低其mRNA表达水平(P＜0.05),来正向调节玻璃化冷冻卵母细胞IVF胚胎的发育情况,提高胚胎发育能力,使得其卵裂率和囊胚率都得到显著提高(P＜0.05),同时促进胚胎发育相关基因的表达。     

添加HA纳米颗粒对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的影响

为了探究羟基磷灰石(HA)纳米颗粒对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响，试验以牛卵巢中GV期卵母细胞作为试验材料，将不同粒径的HA纳米颗粒添加到玻璃化冷冻液中，进行超声分散检测。首先，以卵母细胞存活率和成熟率为指标，将0、0.01%、0.05%、0.1%HA纳米颗粒分别添加到玻璃化冷冻液Ⅰ(VSⅠ)和玻璃化冷冻液Ⅱ(VSⅡ)中，不经冷冻直接进行毒性测试；然后，以形态正常率、成熟率、卵裂率和囊胚率为指标测定卵母细胞玻璃化冷冻后的发育能力；最后检测含有0.05%HA纳米颗粒的VSⅡ对冷冻后卵母细胞活性氧水平和线粒体膜电位水平的影响。结果表明：不同浓度HA纳米颗粒对牛GV期卵母细胞均无明显毒性；VSⅡ+0.05%HA纳米颗粒组卵母细胞冷冻后的形态正常率、成熟率、卵裂率、囊胚率显著高于VSⅠ+0.05%HA纳米颗粒组(P<0.05);VSⅡ+0.05%HA纳米颗粒组卵母细胞的活性氧水平显著低于VSⅡ组(P<0.05);VSⅡ+0.05%HA纳米颗粒组卵母细胞的线粒体膜电位水平显著高于VSⅡ组(P<0.05)。说明在VSⅡ中加入0.05%HA纳米颗粒能显著降低牛GV期卵母细胞...     

玻璃化冻存对驴卵母细胞超微结构的影响

试验旨在探究玻璃化冷冻对驴卵母细胞发育的影响,寻求驴卵母细胞冷冻的最佳条件。通过对不同发育时期的驴卵母细胞进行玻璃化冷冻,冷冻复苏后分别进行成熟培养和孤雌激活,并对GV期未冷冻组(对照组)、GV期冷冻组、IVM-MⅡ冷冻组卵母细胞微丝和线粒体超微结构进行免疫荧光标记,统计冷冻复苏后卵母细胞形态正常率、成熟率、孤雌激活卵裂率、超微结构正常率。结果表明,GV期冷冻组卵母细胞的形态正常率与GV期未冷冻组(对照组)间无显著差异(P0.05),成熟率和卵裂率均显著低于对照组(P0.05);IVM-MⅡ冷冻组的卵裂率显著低于对照组(P0.05),且卵裂后细胞发育受到阻滞。冷冻组微丝在皮质区分布明显减少的卵母细胞数目增多,冷冻组卵母细胞的线粒体数量明显低于对照组,由此可以说明冷冻对卵母细胞超微结构有损伤,从而导致复苏后成熟率下降,影响卵母细胞的受精和体外发育,且GV期冷冻组较IVM-MⅡ冷冻组在微丝与线粒体结构上有较小损伤,发育状态较好。     

超低温冷冻对牛卵母细胞组蛋白乙酰化和膜蛋白CD9表达的影响

本试验旨在探讨玻璃化冷冻对牛体外成熟卵母细胞(MⅡ期)组蛋白乙酰化和膜蛋白CD9表达的影响。牛MⅡ期卵母细胞采用OPS法冷冻,即卵母细胞于10%EG+10%DMSO溶液中预处理30s,然后再移入玻璃化溶液EDFSF30中处理25s,以OPS为承载器投入液氮中。毒性组卵母细胞未投入液氮,其他过程与冷冻组相同,新鲜牛MⅡ期卵母细胞为对照组。卵母细胞解冻后,利用免疫荧光染色法检测存活细胞DNA组蛋白乙酰化;qRT-PCR和Western blot检测CD9mRNA蛋白的表达。结果表明:冷冻组卵母细胞形态正常率(93.8%)和存活率(92.7%)显著低于毒性组(100.0%,97.2%)和对照组(100.0%,98.5%)(P<0.05),而毒性组与对照组之间无显著差异。超低温冷冻后,卵母细胞DNA组蛋白乙酰化水平显著上升(P<0.05),CD9mRNA与蛋白表达显著降低(P<0.05)。以上显示,玻璃化冷冻不但降低了牛体外成熟卵母细胞的存活率,而且改变了DNA组蛋白乙酰化和膜蛋白CD9表达水平。     

玻璃化冷冻后小鼠卵母细胞及其早期胚胎中DNA甲基转移酶的表达模式

卵母细胞玻璃化冷冻导致的胚胎发育阻滞与其DNA甲基化模式的异常密切相关。本研究以小鼠为模型,旨在探讨玻璃化冷冻对卵母细胞及其形成的早期胚胎中DNA甲基转移酶(DNMTs)表达模式的影响。采用免疫荧光染色结合激光共聚焦显微成像技术检测了DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在新鲜和冷冻卵母细胞及其形成的各阶段早期胚胎中的表达与分布,结果表明:在卵母细胞及受精后的合子中冷冻组3种DNMTs的表达均出现了异常。采用实时定量PCR技术检测了新鲜和冷冻卵母细胞及其形成的囊胚中,Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b的m RNA表达水平,显示在冷冻卵母细胞中3种Dnmts的表达水平均显著下降,至囊胚阶段Dnmt3b的表达水平仍然很低(P0.05)。研究结果表明卵母细胞玻璃化冷冻导致了小鼠早期胚胎发育过程中DNMTs表达模式的异常,这可能是DNA甲基化异常的重要原因之一。