抗草甘膦转基因玉米AG16分子特征和抗性鉴定

抗草甘膦转基因玉米(Zea mays)能有效降低杂草防治成本,具有重要的应用前景。浙江大学转基因抗虫植物和生物安全实验室前期通过农杆菌介导法,以玉米Hi-Ⅱ品种为受体导入新型抗草甘膦基因G10evo,获得不同的抗草甘膦玉米转化系。在此基础上,筛选了具有良好草甘膦抗性的转基因玉米转化系AG16。本研究利用PCR、Western杂交、Southern杂交、ELISA等方法对AG16进行分子特征检测,并对AG16的草甘膦抗性水平进行鉴定。结果表明,G10evo在AG16中为单拷贝插入;G10evo蛋白在AG16的根、茎和叶组织中表达;ELISA分析表明,草甘膦喷洒前,嫩茎中G10evo蛋白的表达量达到9.975μg·g-1。温室中草甘膦抗性测定结果显示,AG16能抗4~8倍田间浓度的草甘膦,远高于草甘膦在实际生产中的使用量。因此,AG16草甘膦抗性水平达到生产需求,具有产业应用潜力,为培育具有自主知识产权的抗草甘膦玉米提供了种质资源。     

钙依赖蛋白激酶基因表达载体的构建及其对拟南芥的遗传转化

将钙依赖蛋白激酶(CDPK)基因插入到植物表达载体pBI121上,构建成特异性表达载体pBI121-CDPK,并采用农杆菌介导法将其转化进入拟南芥Arabidopsis thaliana Columbia生态型品种中,获得了卡那霉素筛选的抗性植株,通过PCR扩增验证,拟南芥基因组中含有此抗性基因.     

口蹄疫病毒VP1基因在转基因拟南芥种子中的表达及活性检测

构建了FMDV VP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438/VP1,在根癌农杆菌GV3101的介导下,通过浸花法转化拟南芥花序,转基因拟南芥通过卡那霉素抗性筛选后,进行了目的基因PCR扩增和ELISA检测,对ELISA筛选的阳性植株进行Western blot检测,并对转基因拟南芥后代进行了目的基因PCR分析.结果表明,种子特异性表达载体p7SBin438/VP1构建正确,FMDV结构蛋白VP1编码基因已整合进拟南芥基因组并获得表达,表达蛋白具有免疫反应活性,转基因拟南芥后代分析表明VP1基因已经遗传给后代.本试验为将FMDV免疫基因向豆科植物种子中的转化提供了依据.     

双价抗虫植物表达载体p3300-bt-pta转化苜蓿的初步研究

以中苜1号无菌苗子叶为外植体,采用农杆菌介导的叶盘法,将含有CryIA(a)/CryIA(c)基因、半夏凝集素(pta)基因和bar基因的双价抗虫植物表达载体p3300-Bt-pta导入苜蓿子叶中,在含除草剂的筛选培养基中连续筛选,获得抗性转化植株.研究了农杆菌菌液浓度、浸染时间、共培养时间等因素对苜蓿转化效率的影响,结果表明:各因素对苜蓿转化率均有不同程度的影响,当转化的菌液浓度OD600为0.6、浸染时间为10min、共培养时间为3d时转化效率较好.载体的抗性基因为除草剂草丁膦抗性的Bar基因,对子叶外植体的最佳筛选浓度为8mg/L;抑制农杆菌所用Carb的有效工作浓度为400mg/L,以后继代逐次减少用量到100mg/L;按此方法以根癌农杆菌菌株EHA105介导,将双基因Bt和pta导入紫花苜蓿品种"中苜1号",最终获得122棵除草剂草丁膦(ppt)抗性的植株,经过初步的PCR及RT-PCR分子生物学检测,有30棵检测到特异性条带,表明外源基因已成功整合到苜蓿基因组中,并在转录水平得到表达.     

抗草甘膦大豆粕外源DNA在肉鸡体内代谢研究

使用PCR方法,在肉仔鸡胸肌和腿肌中,未检出来源于抗草甘膦的转基因豆粕外源cp4 epsps基因;在盲肠食糜和粪便中却检出外源基因,但出现率很低。这表明,在现有的检测条件下,外源DNA的完整性在肉鸡消化道很大程度被破坏,没有进入鸡肉中。     

过量表达甘菊CBF1基因提高拟南芥抗旱耐盐能力

CBF是一类植物特异性、具有多种功能的转录因子。本研究将从甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)中分离的ClCBF1基因构建到植物表达载体pBI121上,并采用农杆菌介导的花序浸染法对拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行遗传转化,共获得4个转基因株系经过抗性筛选和RT-PCR验证,对其中表达量较高的3个转基因株系进行研究,结果表明:在150mmol·L~(-1)甘露醇培养基中转基因拟南芥的种子萌发率和根长平均为野生型的2.0倍和1.2倍,在150mmol·L~(-1) NaCl培养基中转基因拟南芥种子萌发率和根长平均为野生型的1.1倍和1.4倍;在干旱和盐胁迫条件下,转基因拟南芥幼苗的成活率高于野生型,并且超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性显著高于野生型(P0.05),丙二醛(MDA)含量及相对电导率显著低于野生型植株(P0.05)。说明ClCBF1基因在拟南芥受到干旱和盐胁迫过程中发挥一定作用。     

piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。     

紫花苜蓿MsPOD基因的克隆及对拟南芥的转化

利用RT-PCR技术从紫花苜蓿中克隆出过氧化物酶基因,命名为MsPOD,并通过DNA重组技术将其连接到载体pBI121上,成功构建植物表达载体pBI-MsPOD;将表达载体转化到感受态农杆菌株GV3101中,利用花序浸泡法获得具有卡纳抗性的转基因拟南芥植株.对其中3个再生植株进行PCR检测表明,目的基因已经成功整合到拟南芥基因组中,通过RT-PCR和GUS染色检测分析,初步证明目的基因在拟南芥中成功表达.     

基于2b-RAD技术的家蚕BmNPV抗性关联基因的全基因组筛查

不同家蚕品种对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的抵抗性存在较大差异,家蚕抗性品系AN、野BN对Bm NPV侵染具有较强的抵抗性。用易感家蚕品系C108分别与AN和野BN杂交、回交,构建两个抗性品系的BC3M和BC4M分离群体,利用简化基因组测序技术2b-RAD(基于IIB型限制性内切酶的RAD)进行亲本和杂交分离群体的基因组测序,通过生物信息学方法筛选位于染色体上与抗性相关的多态性SNP标记,进行抗性品种的基因型分析。对3个亲本及2个抗性分离群体样本基因组DNA构建的2b-RAD标签文库进行Illumina测序,获得抗性亲本AN、野BN的多态性SNP标记11 919个和12 293个。对抗性分离群体全基因组染色体的Bm NPV抗性关联SNP标记指数(SNP-index)进行分析,结果表明亲本品系AN、野BN的Bm NPV抗性相关SNP标记分布在多个染色体上,其中AN的全基因组中抗性贡献率前5位是第5、10、27、23和4号染色体,野BN的全基因组中抗性贡献率前5位的是第4、27、15、18和6号染色体,有多个SNP-index高值位点与已知Bm NPV抗性相关基因的位置具有较高的一致性。推测AN、野BN两个品系的Bm NPV高抗性与抗性主基因和其他抗性基因的联合作用有关。     

家蚕抗核型多角体病毒病分子标记辅助新品种选育研究

利用分子标记技术开展向家蚕实用品种中导入核型多角体病毒病抗性基因的研究.实验结果发现已报道的分子标记在不同品种间表现出差异,与抗性性状并非完全相关.添毒结合标记检测,筛选出抗性品种"多化N"和敏感性的实用品种"春华"作为育种素材,并从特定品种"多化N"中获得了特异性连锁片段.通过组配近等基因系,结合添毒试验在BC<,3>-F<,2>代抗性个体中明显检测到该标记.     

日本结缕草ZjADH基因对拟南芥的转化及其耐寒性分析

为研究日本结缕草ZjADH基因是否与植物耐寒有关,通过DNA重组技术将ZjADH基因插入3302Y质粒中,成功构建了植物表达载体3302Y-ZjADH,通过农杆菌介导的花序侵染法获得具有草铵膦抗性的转基因植株。PCR和qRT-PCR鉴定表明,目的基因已整合入拟南芥基因组中并能够成功表达。对野生型和转基因拟南芥进行低温(4 ℃)处理和耐寒分析,结果表明,转基因拟南芥对低温胁迫的抵抗能力明显高于未转基因植株。在低温胁迫下,转基因拟南芥中脯氨酸的含量显著高于野生型植株,而活性氧的积累明显低于野生型植株;对转基因植物抗性相关基因的表达分析显示:转基因植物体内SOD、APX及LEA基因的表达水平明显高于未转基因植株,说明ZjADH基因可能通过提高转基因植物体内SOD、APX及LEA的表达活性来增强植物的抗寒性。综上所述,日本结缕草ZjADH基因的表达能够提高转基因植株的耐寒性,对ZjADH基因的研究也为进一步获得抗寒转基因日本结缕草植株奠定理论依据。     

桑树中拟南芥同源基因mNHX1的克隆及其功能研究

通过RT-PCR法从桑芽的全RNA中逆转录合成了桑芽cDNA库,以此为模板,用PCR技术克隆了拟南芥的同源基因mNHX1,该基因是编码植物细胞液泡膜上Na+/H+逆向运转蛋白的基因。用农杆菌法将mNHX1导入拟南芥,获得了过量表达转基因植株,并进行了功能研究。从51个转基因抗性植株中共筛选到18个纯系。结果表明,转mNHX1基因的拟南芥种子在含有100~200 mmol/L NaC l的MS培养基上,种子的发芽率明显高于野生型。同时,在含有150、250 mmol/L浓度NaC l的基质中,转基因植株的抗盐性能明显高于野生型。根据已报道的At-NHX1同源基因的功能推断,mNHX1所编码的细胞液泡膜上Na+/H+逆向运转蛋白是桑树抗盐性能的一个极其重要的因素。     

白羊草BiMYB52基因的克隆及转基因拟南芥抗旱性表达分析

白羊草(Bothriochloa ischaemum)是一种耐旱的优良乡土草种。为了探索白羊草转录因子MYB的结构和功能,本研究以白羊草转录组测序中筛选出的一段对干旱胁迫响应表达量变化显著的MYB序列为基础,采用基于拓扑异构酶快速克隆法从白羊草中克隆了一个R2R3-MYB基因BiMYB52,该基因编码237个氨基酸。为了深入研究BiMYB52基因的抗旱性,利用染色体步移技术扩增出了BiMYB52启动子序列,构建了pCAMBIA1301-BiMYB52过表达载体,采用农杆菌介导的花序侵染法对拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行遗传转化,然后对野生拟南芥和转基因拟南芥进行干旱胁迫处理。结果表明,干旱胁迫复水后,转基因拟南芥的存活率显著高于野生拟南芥,丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量是干旱胁迫后转基因拟南芥的显著低于对照,脯氨酸(Proline, Pro)含量则显著高于对照。由此推测BiMYB52基因可能增加了拟南芥对干旱胁迫的抵抗能力。这为白羊草抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

转OvBAN/bar双价基因的紫花苜蓿对虫蚀及除草剂的耐受性分析

以"甘农3号"紫花苜蓿为受体,利用农杆菌介导法导入双价基因OvBAN/bar,通过PCR检测和Southern杂交分析表明,4个转基因株系含有目的基因且均出现杂交条带,其中2个株系为单拷贝,1个株系为双拷贝,1个株系为三拷贝;对获得的4株转基因苜蓿进行qRT-PCR分析表明,具有三拷贝数的1个转基因株系OvBAN基因的表达量最高,其次为双拷贝数的2个转基因株系,并且这些株系的花青素还原酶活性及缩合单宁含量均显著高于野生型苜蓿。以过量表达OvBAN基因的3株转基因苜蓿为试验材料,进行抗蚜性和除草剂耐受性分析。结果表明,与野生型苜蓿相比,转OvBAN/bar基因苜蓿对苜蓿蚜都具有较好的抗性,蚜虫抑制率为78%~93%;用0.5%的市售草铵膦喷施各株系,10d后各转基因株系除个别叶片枯萎死亡,其他叶片及茎秆生长状况良好,而野生型苜蓿全部枯萎死亡,表明bar基因已整合到转基因苜蓿基因组中并稳定表达。综上所述,转OvBAN/bar基因紫花苜蓿表现出良好的抗虫性和除草剂耐受性。     

日本结缕草ZjZFN1基因对拟南芥的转化及其耐旱性分析

锌指蛋白在植物干旱胁迫中起重要作用,尽管已经在各种植物中克隆并鉴定了编码这些蛋白质的基因,但是它们在日本结缕草中的功能和潜在的转录机制还不清楚。通过花序侵染法将ZjZFN1基因及其启动子转化拟南芥,并通过草铵膦/潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得转基因株系。ZjZFN1的启动子能够驱动GUS基因的表达,在甘露醇处理下的GUS基因表达水平显著高于对照;在拟南芥中过表达ZjZFN1降低了种子发芽率,减弱了植物对干旱胁迫的适应性和植物在干旱胁迫下的生长状况;干旱处理后,转基因植株中的丙二醛含量高于野生型植株,而脯氨酸含量显著低于野生型植株;实时荧光定量分析表明对过表达ZjZFN1的拟南芥进行干旱处理后,POD、SOD、P5CS、LEA的表达水平降低,而APX的表达水平升高。ZjZFN1基因的过表达可减弱植物的耐旱性,为进一步开发利用该基因奠定基础。     

紫花苜蓿MsMYB2基因的克隆及转化

为获得MsMYB2基因过量表达的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株,利用PCR技术在紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆出MYB2基因并命名为MsMYB2,MsMYB2基因编码区全长834 bp,编码1条长度为278个氨基酸的多肽链。通过DNA重组技术将其与pBI121连接,成功构建了植物表达载体pBI-MsMYB2。通过花序侵染法获得具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株,并通过PCR和RT-PCR对目的基因进行检测,结果证明目的基因已整合到拟南芥基因组中并且可以表达,成功获得了MsMYB2基因表达的拟南芥转基因植株。     

人工改造野生大豆GsDREB2基因对植物耐盐和耐渗透胁迫能力的影响

DREB (dehydration responsive element binding protein)转录因子是一个干旱应答元件的结合蛋白,它能特异结合启动子中含有DRE/CRT顺式元件,激活逆境诱导基因的表达,调控植物对干旱、低温、高盐、高温等胁迫的耐逆性。大量研究表明DREB转录因子在信号传导、作用机理及基因表达方面存在复杂性。为了野生大豆来源GsDREB2基因能更有效地发挥功能,人工突变该基因的负向调节结构域(negative regulatory domain, NRD,140~204),经改造命名为GsDREB2-mNRD。在酵母中比较全长基因(FLDREB2)和GsDREB2-mNRD转录激活和与DRE元件结合的能力,并验证GsDREB2-mNRD核定位情况。分别将FLDREB2和GsDREB2-mNRD转化拟南芥,通过拟南芥幼苗期盐胁迫和渗透胁迫试验,比较GsDREB2-mNRD和FLDREB2在提高植物耐盐和渗透胁迫方面的差异。结果表明,GsDREB2基因内部存在着负向调节结构域(NRD),抑制了GsDREB2转录激活功能和DRE元件结合的特性;经改造的GsDREB2基因依然能定位在细胞核;超量表达GsDREB2-mNRD基因的拟南芥耐盐和渗透胁迫能力明显强于非转基因对照,也高于FLDREB2基因超表达的拟南芥;野生大豆来源的GsDREB2基因NRD结构域的缺失可增强该基因在植物耐盐、渗透胁迫等逆境胁迫下的功能。     

异源表达WZY2-1基因提高拟南芥植株抗旱性

脱水素是受细胞失水相关环境诱导表达的一类蛋白家族。所有的脱水素都含有保守的K片段,这段保守序列可以形成两亲性的α-螺旋,这种结构在脱水素发挥功能中起主要作用。小麦WZY2-1基因含有9个K片段,属于K9型的脱水素,能够被低温、干旱和盐胁迫诱导表达。在本实验中,纯化了WZY2-1蛋白,通过体外LDH酶保护实验发现,WZY2-1蛋白具有保护LDH酶活性的功能。通过亚细胞定位分析发现,WZY2-1蛋白主要定位于细胞核和细胞膜。为了进一步说明WZY2-1基因的功能,获得了转WZY2-1基因的拟南芥植株,通过干旱胁迫条件下转基因植株的生理指标和表型分析,发现转WZY2-1基因的拟南芥植株具有较强的抗旱能力。因此,推测小麦WZY2-1基因在植物干旱胁迫条件下具有重要功能。     

转玉米ZmABI3-L基因增加拟南芥的抗旱和耐盐性

ABI3 (abscisic acid insensitive 3) 是编码 ABA 信号转导途径中的重要调控因子,广泛地存在于玉米、小麦、水稻等谷类作物中。本研究从玉米中获得一个新的 ABI3-like 基因,命名为ZmABI3-L,该基因全长1735 bp,开放阅读框1212 bp,编码蛋白含404个氨基酸。同源比对表明ZmABI3-L和谷子、高粱的同源蛋白相似性高,分别为64%和58%。基因的表达分析表明该基因是组成型表达,在幼胚、穗子和花丝中表达量较高,同时基因的转录水平可以为盐、ABA、干旱和冷所诱导。将ZmABI3-L基因转化到拟南芥中,对T₃代转 ZmABI3-L基因拟南芥进行抗逆性分析,结果显示ZmABI3-L基因可以增强拟南芥的耐盐和抗旱能力。在150 mmol/L高盐培养基中转基因拟南芥的根和茎长度分别为对照的 8.6 和 1.4 倍,在50 mmol/L甘露醇的渗透培养基中转基因植株的发芽率是74.5%,而对照仅为 33.6%。研究表明 ZmABI3-L是一个对干旱和盐损伤均有响应而显著上调的基因,同时该基因可以增加拟南芥的抗旱和耐盐性。     

紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因的表达及抗逆性分析

根据NCBI中紫花苜蓿1型金属硫蛋白基因(MET1, 登录号:AF189766.1)cDNA序列设计一对特异性引物,以紫花苜蓿品种“农菁1号”的cDNA为模板,利用PCR技术克隆出的一个基因,命名为MsMT1,测序发现该基因全长228 bp,编码75个氨基酸。通过碱基序列比对发现MsMT1与MET1的相似度为99%。通过氨基酸序列分析和进化树分析,发现与其他植物的1型金属硫蛋白基因具有较高的同源性。利用qRT-PCR对MsMT1在苜蓿不同器官中的表达进行分析,发现该基因在根和子叶中表达量较高。将苜蓿幼苗进行不同浓度NaCl、Na₂CO₃、NaHCO₃及不同pH值胁迫处理后, 观察MsMT1基因的表达,发现MsMT1的表达量随盐碱处理液浓度和pH值变化发生改变,说明MsMT1与植物的抗逆性相关。采用农杆菌介导法将MsMT1导入苜蓿植株体内,卡那抗性的筛选和Northern blot结果显示MsMT1基因能够在转基因苜蓿中高效表达。用不同浓度NaCl、NaHCO₃处理野生型和转化MsMT1基因的苜蓿幼苗,观察幼苗受胁迫后的表型,发现转基因的苜蓿幼苗比未转基因的苜蓿幼苗抵抗力高。本研究表明MsMT1基因能够增加苜蓿对胁迫的抗性。