幼兔腹泻轮状病毒的鉴定

用直接电镜（EM）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和ELISA检测了35份幼兔腹泻粪便样品，从中发现了轮状病毒（RV）抗原和RVRNA，并见到了典型的完整RV粒子，从而首次在国内检测出兔RV。新检测出的两株兔RVRNA电泳型为4、2、3、2，短型，归属于A组RV的第Ⅰ亚组。     

鸡轮状病毒核酸及抗原的检测

用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和对流免疫电泳自125份有腹泻症状的死亡雏鸡小肠内容物样品中检测出轮状病毒(RV)抗原及RVRNA,检出率分:别为34.4%(43/125)和2.4%(3/125).用 PAGE 从雏鸡小肠内容物样品中检出一株 D 组禽副 RV 和3株 C 组禽副 RV,从而在国内检测出 C 组禽副 RV,此外,对鸡 RV RNA 电泳型进行了分析,并证明了鸡普通 RV 抗原的存在.     

枯草芽孢杆菌对轮状病毒感染IPEC-J2细胞相关TLRs mRNA表达的影响

为研究枯草芽孢杆菌(B.subtilis)是否通过激活猪肠上皮细胞(IPEC-J2)中Toll样受体(TLRs)的表达抑制轮状病毒(RV)的复制,本研究采用RV感染灭活B.subtilis预处理的IPEC-J2细胞,鉴定B.subtilis对RV在细胞中增殖的抑制作用,并检测不同时间点RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞中相关TLRs的表达。结果显示,RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞24 h后,与未处理细胞相比,其病毒的增殖能力显著被抑制。通过荧光定量PCR检测不同处理组细胞TLRs m RNA的表达水平,结果表明RV感染B.subtilis预处理IPEC-J2细胞在感染早期(1 h和3 h)与其他组相比,TLR2、TLR3、TLR9 m RNA表达均显著增加。本研究表明,灭活的B.subtilis能够抑制RV在IPEC-J2细胞中的增殖,并在病毒感染初期显著提高细胞TLRs m RNA表达,推测可能与调节宿主细胞的先天免疫反应有关。     

仔猪轮状病毒核酸的检测

用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检查了二个猪场的42份仔猪腹泻粪样。轮状病毒(RV)核酸(RNA)检出率分别为11.1%(3/27)和33.3%(5/15)。通过PAGE 法,检出了5株 A 组 RV 和5株 C 组 RV,证实了 A组 RV 和 C 组 RV 可同时感染某一猪场和混合感染同一只猪。     

靶向狂犬病病毒N基因shRNA抑制狂犬病病毒复制的研究

为探讨小干扰RNA(siRNA)对狂犬病病毒(RV)复制的干扰作用,以RVN基因为靶向目标,设计合成4对编码siRNA的DNA序列,然后分别连接到载体pRNATU6.3-Hygro上,转染BHK细胞,在潮霉素-B抗性压力下筛选出4个阳性细胞株(BHK-N1、BHK-N2、BHK-N3和BHK-N4)。用100TCID50CVS-11毒分别感染24孔板内的上述细胞,利用Real-time RT-PCR、半数细胞培养物感染量(TCID50)、直接免疫荧光和Western blot检测抑制效率。接毒后48 h,在BHK-N1、BHK-N2、BHK-N3、BHK-N4细胞株中,Real-time RT-PCR检测到各细胞株均在不同程度上抑制了RV的增殖,其中BHK-N2、BHK-N1抑制效率高,分别为99%、67.72%,而BHK-N3、BHK-N4仅为38.59%和11.33%,抑制效果较弱;TCID50检测病毒数量比空载体表达细胞毒价分别低24、96.2、2.14和1.1倍;直接免疫荧光检测表明,4株细胞中RV含量为病毒对照的31%、1%、54%、82%,即BHK-N1、BHK-N2对病毒的沉默作用较强;Western blot结果显示BHK-N1、BHK-N2细胞株中RV N蛋白条带明显减弱。4种检测结果均表明BHK-N1和BHK-N2能有效干扰RV的复制。本研究在细胞水平筛选出具有高效抑制RV复制的2个靶位点N-489和N-701,为RV的基因功能研究、抗病毒药物的开发奠定了基础。     

猪轮状病毒(G9型)TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立灵敏、特异的G9型猪轮状病毒(Po RV)Taq Man的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的G9型Po RV NMTL株的VP7基因保守区域设计一条特异性引物和探针。以104TCID50的病毒液所提取的总RNA进行10倍系列稀释作为标准品,通过对反应条件进行优化,建立了检测G9型Po RV的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法的相关系数R2=0.991,对其它常见的Po RV(G5)、猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法最低可以检测到的病毒滴度为10-3TCID50,比普通RT-PCR方法灵敏度高约1 000倍;组内和组间变异系数均小于0.87%,稳定性高,重复性好。对疑似感染Po RV的45份临床病料样品进行检测,结果表明,该方法阳性率(64.4%)高于普通RT-PCR(44.4%),两者总符合率为80%。本研究建立的方法为Po RV的流行病学调查和早期诊断奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和轮状病毒多重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和轮状病毒(RV)的多重实时荧光定量PCR方法,试验根据PEDV CV777株、TGEV Purdue P115株全基因序列和RV OSU毒株的VP6基因序列,设计出3对特异性引物及探针,优化反应条件,开展特异性、敏感性、重复性和验证试验。结果表明:该方法的检测最低限为1×10~2拷贝/μL的RNA标准品或1×10~(-2)TCID_(50)/mL的疫苗毒,具有较高的敏感性;变异系数均小于10%,符合统计学要求;利用本试验所建立的方法以及商品化试剂盒对20份临床样品进行检测,符合率为100%。说明本试验建立的方法特异性好,敏感性高,重复性稳定,可用于PEDV、TGEV和RV的鉴别诊断和防控。     

狂犬病病毒及其免疫制剂研究近况

近十余年,狂犬病毒(RV)分子生物学研究已取得显著进展。令人瞩目的是分子克隆和PCR技术的应用,在测定RV全基因及分析其功能以及基因工程疫苗的研制上起了重要作用。 狂犬病病毒的结构蛋白基因 RV RNA的基因序列约12Kb,它有N、NS、M、G和L蛋白。其中研究较多的是N蛋白和G蛋白。N、NS和L组成RV核衣壳蛋白,G构成病毒敕突,M位于包膜上。这五种蛋白均有抗原性。 一、核(N)蛋白 RV核蛋白位于包膜内,核酸周围、它含有磷酸基因,起着保护病毒RNA的作用。它由450个氨基酸组成,约占RV蛋白总量的36％。美国费城Wister     

猪瘟脾淋毒活疫苗中兔瘟外源病毒检测方法的建立及应用

为检测商品化猪瘟脾淋毒活疫苗中RHDV污染,根据兔出血症病毒VP60基因保守序列设计引物,建立了检测兔出血症病毒一步法反转录一聚合酶链(RT-PCR)方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对RHDV扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对兔出血症病毒检测的灵敏性为10皮克总RNA量,应用该方法,检测了20批猪瘟脾淋源活疫苗样品,以上结果表明该一步法RT-PCR方法检测     

猪伪狂犬病病毒、轮状病毒、传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒多重PCR的构建及应用

本试验的目的在于建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪轮状病毒(RV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的多重PCR检测方法.试验设计并合成了4对特异性引物,对样品中的PRV,RV,TGEV和PEDV进行了多重PCR扩增.结果显示,该方法可同时扩增出PRV(497 bp),RV(1356...     

HoBi瘟病毒一步法荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测HoBi瘟病毒的方法,根据GenBank提交的HoBi基因序列,使用软件设计2对引物和1条探针,通过体外转录获得定量标准品RNA。通过对荧光定量PCR将各反应条件进行优化,建立了HoBi瘟病毒一步法荧光定量PCR检测方法。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,对牛病毒性腹泻病毒-1(BVDV1)-NADL、BVDV2-JN、猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病毒(BDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、牛轮状病毒(RV)和伪狂犬病病毒(PRV)核酸检测为阴性;最低核酸检测量为103拷贝/μL;组内变异系数和组间变异系数均小于2%。结果表明,所建立的HoBi瘟病毒一步荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好和快速等特点,可用于HoBi瘟病毒感染的流行病学调查和早期诊断。     

广西家犬及蝙蝠狂犬病病毒监测与分析

为了解广西狂犬病病毒(RV)感染与分布情况,本研究对采集自广西境内9个市31个县(区)1 007份犬脑组织、1 324份犬唾液拭子及564只野生蝙蝠进行RV检测,结果显示有6个县的犬脑组织检测出RV,阳性率为0.65%(1/153)~5.38%(5/93),县(区)阳性率为27.27%(6/22),广西划分的5个地理区域均有分布。外观健康犬和疑似发病犬脑组织平均阳性率分别为1%(10/1 005)和100%(2/2)。犬唾液拭子和野生蝙蝠均未检测到RV。结果表明广西家犬的RV感染率存在一定的地域性差异,平均感染率较低,但个别县(区)连续几年阳性率均处于较高水平,应加强对犬只的管理和疫苗免疫。     

5种商品化试剂提取病毒RNA的比较研究

选择商品化的3种细胞裂解液(RNAiso Plus、TRNzol Plus和RNAOUT)和2种DNA/RNA共提试剂盒(RNA-DNA双提试剂盒、快速DNA/RNA共提试剂盒),分别提取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JXA1-R株、猪瘟病毒(CSFV)HCLV株和乙型脑炎病毒(JEV)SA-14-14-2株的RNA,通过RNA直接定量和Real-time PCR间接评价了抽提的RNA的质量。RNA直接检测结果表明,RNAiso Plus、TRNzol Plus和RNAOUT 3种细胞裂解液抽提获得的RNA浓度相对较高;Real-time PCR间接检测结果表明,快速DNA/RNA共提试剂盒组RNA相对水平最高,RNAiso Plus和TRNzol Plus 2种细胞裂解液组其次。研究表明,RNAiso Plus、TRNzol Plus和RNAOUT 3种试剂可用于临床RNA病毒检测以及定量分析。     

TaqMan MGB探针实时检测兔病毒性出血症病毒

应用荧光定量PCR技术,根据兔病毒性出血症病毒的保守基因VP60设计了1对引物和1段Taqman MGB探针,建立了用于检测兔病毒性出血症病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。试验中能够检出的RHDV VP60基因质粒拷贝数达103数量级,能够检测到RHDV病毒核酸最低量可以达到5 pg,未检出其他病原的RNA。试验结果表明,建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量RT-PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的兔病毒性出血症病毒,适合于兔各脏器及肌肉组织中兔病毒性出血症病毒的快速诊断和检测。     

兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立及其临床应用

本研究旨在建立检测兔群鼻拭子中兔出血症病毒(RHDV)的RT-PCR方法,研究健康免疫兔群是否存在携带RHDV现象。根据GenBank上公布的RHDVvp60基因保守序列,设计了1对特异性引物,经cDNA的合成和PCR扩增,目的片段大小为591bp。结果表明该方法能检出最小RNA浓度为2.40ng·μL-1,敏感性为血凝试验(HA)的8×103倍。通过对自5个省采集的168份健康免疫兔鼻拭子样品进行检测,结果显示,阳性样品为22份,阳性率为13.09%。试验表明:RT-PCR方法能快速、敏感地从健康免疫兔鼻拭子样品中检出RHDV,提示健康免疫兔群存在携带RHDV的现象,该方法适合临床进行大规模病原学检测和兔群携带病毒的调查,具有良好的应用前景。     

“黄白散”对兔接种RHD疫苗后免疫功能的影响

在注射兔病毒性出血症 (RHD)疫苗后 ,30只兔随机分为 2组 ,试验组兔饲喂含 1 5 %黄白散的饲料。从接种到第 1 80天 ,每组取兔 8只 ,每隔 1 5d采血 1次 ,检测血凝抑制 (HI)抗体 ;在接种前 1天及接种后 5、 1 0、 1 7、 2 4、 31、 41、 5 1d ,每组取兔 1 0只 ,采血检测ANAE+淋巴细胞百分率 ;在 1 80、 2 4 0、 30 0d时 ,每组分别取兔 5只做攻毒保护试验。结果表明 :2组兔HI抗体峰值分别为 7 3log2和 9 8log2 ,差异极显著 (P <0 0 1 ) ;试验组疫苗保护期可延长 60d ;试验组ANAE+率从第 1 0天至 5 1天与对照组比较 ,差异极显著(P<0 0 1 )。所以黄白散可增强兔接种RHD疫苗后的特异性免疫功能 ,增强RHD疫苗的免疫效果。     

食淀粉乳杆菌对轮状病毒受体HSC70的影响

旨在探究食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)对轮状病毒(rotavirus,RV)的细胞受体热休克同源蛋白HSC70的调节作用。以饲喂食淀粉乳杆菌的中国昆明鼠乳鼠为试验动物,通过ELISA、qPCR、冰冻切片间接免疫荧光等技术,1～11 d逐日进行空肠组织取样,检测食淀粉乳杆菌对小鼠空肠组织中HSC70调节作用的动态变化。试验分为4组:正常组、病毒组、预防组(先益生菌作用后攻RV)、治疗组(先攻RV后作用益生菌)。试验结果显示,乳鼠体质量的增长率及变化情况与RV的感染相关,并且食淀粉乳杆菌可以显著地治疗及预防RV感染(P<0.05)。对空肠组织中HSC70的检测发现,攻RV后正常组及预防组的热休克同源蛋白HSC70含量在第5天显著高于治疗组和病毒组(P<0.05);在第7,11天时,各组组内热休克同源蛋白HSC70的含量无明显差异(P>0.05);第9天病毒组的热休克同源蛋白HSC70含量显著高于其他组(P<0.05)。HSC70 mRNA含量随天数的增加而减少,正常组下降趋势显著(P<0.05),预防组在第3,4天趋于平缓。攻RV后小鼠肠内HSC70 mRNA的相对表达量在第5,7,11天,呈现为病毒组>预防组>治疗组>正常组(P<0.05),且小鼠肠内HSC70 mRNA的相对表达量在第7天显著升高(P<0.05)。对第9天空肠组织进行冰冻切片-间接免疫荧光检测发现,HSC70主要存在于空肠绒毛组织,且预防组中HSC70明显少于病毒组及正常组(P<0.05)。结果表明,食淀粉乳杆菌可显著抑制RV受体HSC70在细胞中的合成,从而发挥抗病毒作用,为探究食淀粉乳杆菌抗RV机理提供理论依据。     

牦牛轮状病毒VP6基因序列分析及RT-PCR检测方法的建立与应用

轮状病毒(rotavirus,RV)VP6基因是RV的主要分子检测靶点,但该基因的点突变会影响RV的分子检测。本试验的目的是在研究牦牛RVVP6基因遗传变异的基础上,建立检测牦牛RV的RT-PCR方法并应用于临床样本检测。采用Prime 5.0设计引物,从30个牦牛腹泻样本中扩增得到14个位于931—1 338bp牦牛RVVP6基因片段。序列分析结果发现,与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)相比,牦牛RVVP6基因在931—1 110bp间出现多处点突变,而在1 100—1 338bp之间序列高度保守。据此设计检测引物,成功建立了检测牦牛RV的RTPCR方法,具有良好的特异性和稳定性,只扩增出牦牛RV及BRV的特异片段,对其他无关病原无扩增;检测下限为0.45pg·μL~(-1),灵敏性较好。所建立方法对牦牛RV的检出率明显优于现有检测BRV的RT-PCR方法,为牦牛RV病的诊断和流行病学调查提供了可靠的方法;对BRV的检出也与其他方法具有很好的符合率,也可以用于BRV的检测。对234份犊牦牛腹泻粪便样本的RV检出率:西藏为60.00%(36/60)、青海为95.00%(57/60);四川为85.19%(46/54);云南为90.00%(54/60),证明牦牛RV感染是当前导致犊牦牛腹泻的重要原因。     

一株无血凝性兔病毒性出血症病毒的分离与鉴定

<正>兔病毒性出血症(RHD)俗称兔瘟,是由兔出血症病毒(RHDV)引起的兔的一种急性、烈性、高度接触性、病毒性疫病,我国农业部兽医局将其列为二类动物疫病。该病传播速度快,发病率和死亡率都很高,兔群中一旦有兔感染该病,则迅速蔓延至整个兔群,给兔场带来毁灭性的灾难。RHDV属于杯状病毒科(Caliciviridae)兔病毒属(Lagovirus),为正链、单股RNA病毒,RHDV只有一种血清型,具有能凝集人的"O"型红细胞的特性,血凝性与病毒感染和致病性密     

SIRT1对牛卵泡颗粒细胞凋亡及雌激素分泌的影响

本实验旨在研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对牛卵泡颗粒细胞凋亡及雌激素分泌的影响。构建SIRT1基因干扰载体,并转染体外培养的颗粒细胞。实验分为转染SIRT1-sh RNA的干扰组、转染NC-sh RNA的对照组和未转染的空白组,每组设3个重复。流式细胞术检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测细胞内Bax、Bcl-2 m RNA表达;Western Blot检测细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达;ELISA试剂盒检测雌激素水平。结果表明:干扰组颗粒细胞SIRT1 m RNA表达量显著低于对照组与空白组(P0.05),而对照组与空白组之间差异不显著(P0.05);干扰组颗粒细胞凋亡率显著低于对照组与空白组(P0.05);干扰组颗粒细胞Bax m RNA和蛋白质表达显著低于对照组与空白组(P0.05),而Bcl-2 m RNA和蛋白质表达均显著高于对照组与空白组(P0.05);干扰组颗粒细胞培养液中雌激素含量显著低于对照组与空白组(P0.05)。SIRT1基因可以促进牛卵泡颗粒细胞的凋亡,并促进雌激素分泌。