鹅卵泡选择过程中差异表达基因的初步探索

采用银染mRNA差异显示技术筛选并克隆鹅卵泡选择过程中差异表达的基因片段,测序后在Genbank中进行Blast检索分析其同源性.共获得5个差异片段(EST,表达序列标签),经Blast同源性分析发现1个与人甲硫氨酸腺苷基转移酶Ⅱβ亚基(MAT Ⅱβ)同源,同源性为95%,另一个与鸡mKIAA0840基因同源,同源性为94%,其余3个与已知基因或序列无任何同源性,可能是尚未发现的新基因.本研究结果显示鹅卵泡选择过程中的基因表达存在差异,筛选出的5个EST的全序列和功能有待于进一步深入研究.     

藏系绵羊复胃差异表达基因的筛选及功能分析

为阐明藏绵羊瘤胃、网胃、瓣胃与皱胃功能差异的分子机理,试验以藏绵羊为研究对象,采用抑制消减杂交法筛选藏绵羊瘤胃、网胃、瓣胃与皱胃差异表达基因并进行生物信息学分析。结果表明:成功构建了6个藏绵羊瘤胃、网胃、瓣胃与皱胃差异表达的正反向消减c DNA文库;得到了皱胃特异表达的30个EST片段,瘤胃、网胃、瓣胃特异表达的10个EST片段。经Blast X对比发现5个EST片段与已知基因具有较高的序列相似性,且都在皱胃中特异表达。其中胃蛋白酶A、Napsin-A参与蛋白质水解;胃溶菌酶参与菌体蛋白的消化过程;胃饥饿激素调节食欲且促进相关消化酶分泌;锌指蛋白调节胃酸分泌。说明皱胃具有真正的消化功能,而瘤胃、网胃、瓣胃不能分泌消化酶。瘤胃能利用微生物将摄入的饲草发酵分解成小颗粒物质,网胃、瓣胃起筛滤作用。     

用银染mRNA差异显示技术寻找不同生长阶段绵羊皮肤中差异表达基因

利用优化了的银染mRNA差异显示技术(DD-PCR)，比较了出生后40日龄、60日龄和120日龄三个不同生长阶段的绵羊相同部位的皮肤中总RNA的差异表达。结果表明：同一个体不同日龄的绵羊存在着表达量不同的差异表达基因，并初步筛选出了8条重复性好的差异cDNA片段，其中1条表达量不同的差异片段存在于40日龄，5条存在于60日龄，2条为120日龄所特有。本试验将为进一步研究影响绵羊毛性状相关基因在皮肤中的表达提供科学的参考依据。     

牛睾丸差异表达基因Septin10的筛选、鉴定及组织表达研究

本研究旨在筛选出决定或影响公牛睾丸周长(SC)的基因片段,并研究其功能和表达特征,为今后种公牛的选育提供理论基础。用mRNA差异显示技术从睾丸周长极显著差异(P0.01)的睾丸组织中筛选差异表达的基因片段,并用反Northern杂交及荧光定量的方法鉴定筛选的结果,研究筛选出基因的组织表达谱。结果,筛选出1条差异表达片段A71,经测序和BLAST分析发现该片段与牛Septin10基因高度同源(99%),且该基因在肝脏等9个组织中都有表达,在2组睾丸组织中相对表达量差异显著(P0.05)。分析结果表明,Septin10基因是牛睾丸差异表达基因,可作为一个研究牛繁殖性状的候选基因。     

绵羊VEGF-C基因可变剪切体克隆与序列分析

为克隆不同品种绵羊血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因,探寻该基因与绵羊毛囊发育及毛用性状形成的内在关系,本实验利用RT-PCR方法从小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织克隆出VEGF-C基因mRNA并进行生物信息学分析。以皮肤组织cDNA为模板,RT-PCR扩增显示存在多个扩增条带,克隆测序结果发现所有条带均为VEGF-C基因序列。除最长片段为全长VEGF-C基因外,其他均为VEGF-C异构体,片段长度依次为1 318、1 298、1 197、890、732、604 bp。所有异构体均表现为序列中间部位的缺失,分析显示各异构体由不同类型的可变剪切方式组合加工产生。氨基酸分析发现大部分异构体造成移码突变,编码类VEGF-C蛋白小肽,推测可能参与VEGF-C蛋白成熟或功能调节。本研究首次证明VEGF-C基因在绵羊皮肤组织存在复杂的转录后加工过程,为进一步研究VEGF家族在绵羊皮肤组织中的功能奠定基础。     

内蒙古阿尔巴斯绒山羊与蒙古绵羊BMP2基因片段的克隆及该基因在绒山羊皮肤组织中的表达

从阿尔巴斯绒山羊及蒙古绵羊血中提取基因组DNA，PCR扩增绒山羊及蒙古绵羊的BMP2基因片段，克隆到pMD18－T载体，筛选阳性克隆提取质粒DNA测序，和GenBank数据库进行比对。结果山羊与蒙古绵羊BMP2基因片段在核苷酸水平的同源性达99％，与人、小鼠、牛的同源性分别为87％、85％、99％。将克隆得到的山羊及蒙古绵羊BMP2基因片段体外转录成用地高辛标记的RNA探针，利用原位杂交方法研究BMP2基因片段在绒山羊75d胎儿皮肤和成年羊10月皮肤组织中的表达情况，结果发现在75d胎儿皮肤的毛球部位有表达信号，成年羊在10月皮肤毛囊中没有表达信号，说明BMP2基因和绒山羊毛囊发育有关。     

山羊高繁殖力相关基因的筛选与分析

为查找与山羊繁殖力相关的基因,进一步研究繁殖力调控的遗传机制,本研究选用12只冀中山羊,按照其繁殖记录分为高产和低产2组,应用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)技术,分析了山羊在发情期卵巢组织基因表达的差异。经二次扩增、反式Northern以及半定量PCR验证分析,最终得到4个表达量差异的阳性片段。所得片段经克隆测序提交至GenBank,并进行BLAST分析。结果,4个差异片段中2条为新发现的表达片段,在NCBI中未发现高度同源序列。1条与野猪中获得的克隆片段THY010003E05同源性为81%,但功能未知。另1条差异片段的序列与牛PCNP的mRNA序列的同源性为94%。结果提示,该片段所属基因应属于PCNP基因,结合对其功能的分析结果,推测PCNP可能通过参与卵细胞生成过程中的细胞周期调控影响山羊繁殖力。     

HGTP基因与羊毛细度的相关性分析及其启动子活性研究

本研究旨在构建高甘氨酸-酪氨酸蛋白(HGTP)启动子荧光素酶报告基因载体并验证其活性,阐明HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤毛囊组织中的表达差异与羊毛经济性状的关系。运用PCR方法扩增HGTP基因启动子序列片段,克隆至pGL3-Basic载体中构建重组质粒,并通过双酶切验证和测定核酸序列鉴定;转染皮肤成纤维细胞并检测报告基因的活性;测定羊毛的纤维直径、长度的数据,利用实时荧光定量PCR分析HGTP基因在不同品种绵羊的皮肤毛囊组织中的表达情况。结果显示,萨福克羊与中国美利奴羊的羊毛纤维直径及自然长度差异极显著(P0.01),HGTP基因表达水平与羊毛纤维直径存在极显著的高度正相关(P0.01),与羊毛自然长度呈现显著的中等负相关(P0.05),而羊毛直径与自然长度之间存在极显著的高度负相关(P0.01)。HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤组织中的表达水平差异极显著(P0.01)。启动子活性荧光素酶检测结果显示,KAP6.1、KAP7和KAP8.1启动子元件在绵羊皮肤成纤维细胞和3T3细胞中均有表达,且在绵羊成纤维细胞中的活性极显著高于在3T3细胞中的活性(P0.01)。HGTP基因可以作为研究羊毛纤维直径、自然长度的候选基因。构建不同长度的表达载体,转染皮肤成纤维细胞,获得的2个启动子元件都能驱动外源基因在体外细胞水平表达。绵羊HGTP基因启动子的功能研究为调控羊毛发育提供了理论依据。     

绵羊VEGF-B基因可变剪切体克隆与鉴定

为克隆绵羊血管内皮生长因子B(VEGF-B)基因,探寻该基因与毛囊发育及毛用性状形成的潜在关系,本文利用RT-PCR从小尾寒羊与新吉细毛羊皮肤组织克隆出VEGF-B基因mRNA并对不同组织中VEGF-B基因表达进行分析。扩增显示存在2条扩增条带,克隆测序发现均为VEGF-B基因,大小为978 bp和877 bp。分析发现片段中间部位缺失导致编码氨基酸序列改变,但并未破坏PDGF功能结构域,仅引起一端蛋白酶切位点改变。不同组织器官中两突变体表达检测发现具有组成型表达的特点。定量检测发现VEGF-B在肺脏和卵巢组织中较心脏组织表达升高,脾脏、肾脏与心脏表达持平。肠道、肝脏、脑及肌肉组织则表达降低。本研究成功克隆了绵羊VEGF-B基因并对其进行了系统的鉴定分析,为进一步研究绵羊VEGF家族功能奠定基础。     

SHH在美利奴羊与小尾寒羊背部皮肤表达差异的研究

为了研究音猬因子(sonic hedgehog, SHH)在不同品种绵羊背部皮肤中的表达差异,以探索SHH与羊毛弯曲形成的关系,选取美利奴羊和小尾寒羊作为研究对象,利用HE染色法观察2种绵羊背部皮肤的组织结构,采用免疫组织化学技术、实时荧光定量PCR和Western blot方法探究2种绵羊背部皮肤中SHH蛋白和基因水平的相对表达量差异。结果显示:HE染色显示美利奴羊与小尾寒羊背部皮肤毛囊的组织结构存在毛囊数量及弯曲程度等差异;免疫组织化学试验显示,SHH蛋白在美利奴羊和小尾寒羊背部皮肤中均有表达,在美利奴羊背部皮肤中的毛乳头、毛基质、内外根鞘、皮脂腺和表皮细胞中显著表达,在小尾寒羊背部皮肤中的毛基质、内外根鞘和皮脂腺中显著表达;光密度分析显示,美利奴羊背部皮肤组织中SHH蛋白的表达量显著高于小尾寒羊(P<0.001);实时荧光定量PCR显示,美利奴羊SHH mRNA相对表达水平显著高于小尾寒羊(P<0.01);Western blot显示,美利奴羊SHH蛋白相对表达水平显著高于小尾寒羊(P<0.01)。提示:羊毛弯曲的形成与其组织结构有关,并受SHH的调控。     

新吉细毛羊角蛋白的EST筛选及表达研究

试验旨在从新吉细毛羊皮肤组织表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)中筛选与毛囊发育相关基因并探讨其表达模式与羊毛细度的相关性。利用组装、比对软件Trinity与Blat对新吉细毛羊皮肤组织ESTs组装、注释进而筛选与毛囊发育相关基因,并通过实时荧光定量PCR相对定量方法以2^-△△Ct值检测相关基因在不同绵羊个体中的表达规律。结果显示,从474条ESTs中筛选注释获得了4个与毛囊发育相关的角蛋白基因KRT27、KAP3.2、KAP11.1和KAP8.1;4个角蛋白基因在超细型细毛羊皮肤组织表达量极显著高于细型细毛羊的表达量(P<0.01);4个角蛋白基因表达量:KRT27 >KAP3.2 >KAP11.1 >KAP8.1。该研究为角蛋白基因在细毛羊转录水平上的研究提供了一定数据。     

ITGB2基因在苏博美利奴羊不同细度皮肤组织中的DNA甲基化及mRNA表达水平分析

本研究旨在分析ITGB2基因在苏博美利奴羊不同细度皮肤组织中的DNA甲基化和mRNA表达水平。以苏博美利奴羊周岁母羊为试验动物,以不同细度的皮肤组织样为试验样本,对ITGB2基因（GenBank登录号：NC_040252.1）启动子区CpG岛进行预测并设计BSP引物,并对ITGB2基因（GenBank登录号：NM_001009485.1）、GAPDH基因（GenBank登录号：NM_001190390.1）mRNA序列设计引物,采用重亚硫酸盐测序法（BSP法）进行扩增纯化后将其连接pMD19-T载体,转化JM109细胞过夜培养,形成单菌落,筛选阳性克隆菌进行测序,对所获序列进行分析,分析ITGB2基因启动子区CpG岛在周岁母羊皮肤组织的甲基化模式,并运用实时荧光定量PCR检测ITGB2基因在苏博美利奴羊不同细度皮肤组织中的mRNA表达水平。结果显示,极细组苏博美利奴羊CpG岛甲基化率（94.29%）高于极粗组苏博美利奴羊的CpG岛甲基化率（87.62%）,其中,极细组苏博美利奴羊CpG2、CpG3、CpG4、CpG7甲基化率（100%、100%、100%和80.00%）均高于极粗组（86.67%、93.33%、80.00%和73.33%）;ITGB2基因在苏博美利奴羊极粗皮肤组织中的表达量极显著高于极细皮肤组织的表达量（P < 0.01）,且ITGB2基因的DNA甲基化水平与mRNA表达量呈明显负相关。研究表明,DNA甲基化对皮肤生长发育有一定作用,可作为一个候选的表观遗传标记用于苏博美利奴羊。     

鸡下丘脑组织表达序列标签初步分析

为了鉴定所构建的鸡下丘脑组织 c DNA文库能否用于下丘脑表达谱的建立 ,从 c DNA文库中随机挑取 12个克隆 ,对其表达序列标签 (expressed sequence tags,ESTs)进行了测定和初步分析。经 BL ASTn和 FASTA3.1分析后发现 ,1个 ESTs在 Gen Bank中可以找到鸡的同源序列 ,4个在其他物种中也可以找到同源序列 ,1个在 ESTs database中有同源 ESTs序列 ,还有 6个为未知功能基因。 12个 ESTs序列均已录入 Gen Bank。     

羊草DREB转录因子的系统发育和功能研究

羊草是兼具经济价值和生态价值的重要牧草,具有耐寒、耐旱和耐盐碱的特点。在植物应对非生物胁迫的过程中,DREB转录因子起到关键作用。然而,目前在GenBank的核酸数据库和EST数据库中羊草仅有2条DREB序列,其中只有1个DREB基因的功能得到实验验证。本研究从羊草转录组测序数据中1次挖掘了26条DREB EST。用羊草EST和拟南芥基因组中DREB基因的蛋白序列构建了系统发育树, LcDREB21位于第4类群,是DREB2类转录因子基因。通过RACE,获得了LcDREB21编码区全长(Genbank登入号:JN860437)。荧光定量PCR结果表明,其表达受干旱和高盐诱导。另外,通过酵母单杂交实验证明了LcDREB21具有转录激活功能;通过表达GFP融合蛋白证明其专一性定位在细胞核中。总之,LcDREB21是一个具有转录激活功能和细胞核专一定位能力的转录因子,可能在植物应对干旱和高盐胁迫的过程中起作用。本实验结果丰富了羊草抗逆基因数据库,为植物改良提供了基因资源。     

绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析

本试验旨在获得中国美利奴羊成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）基因的编码区（CDS）全长序列并进行生物信息学分析，随后对FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达特征进行分析，明确其在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达模式，为进一步研究FGF10 mRNA表达水平与中国美利奴羊毛囊生长发育的表达调控机制奠定理论基础。采用PCR扩增获得中国美利奴羊FGF10基因CDS，并克隆到zero PCR@^TM-Blunt进行测序验证；利用实时荧光定量PCR技术检测FGF10在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达差异。结果表明，绵羊FGF10基因CDS长度为696 bp（序列上传GenBank，获得登录号：MT872422），编码231个氨基酸，与牛和山羊的氨基酸序列同源性达100%，存在1个信号肽和1个跨膜结构域，其为分泌通路信号蛋白；实时荧光定量PCR分析表明，FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中均表达，在毛囊发育第85天表达最高，显著高于其他毛囊发育时期（P<0.05）。本研究获得中国美利奴羊FGF10基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特征，生物信息学分析发现，FGF10基因编码区序列具有物种间的保守性，同时FGF10在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达，由此表明，FGF10基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要的生物学作用。     

绵羊KAP11.1基因克隆、原核表达及皮肤毛囊表达研究

【目的】 对毛囊角蛋白关联蛋白11.1（keratin associated protein 11.1,KAP11.1）基因进行克隆及原核表达,并对KAP11.1基因在不同品种绵羊皮肤毛囊中表达量进行比较,探究KAP11.1基因在南疆地方绵羊品种间表达差异及其对羊毛品质的影响。【方法】 以平原型和田羊、山区型和田羊和卡拉库尔羊体侧皮肤毛囊为研究材料,以GenBank中绵羊KAP11.1基因序列（登录号：HQ595347.1）为参照设计引物,对KAP11.1基因进行PCR扩增,构建pMD19-T-KAP11.1克隆质粒,双酶切鉴定后构建pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测;利用实时荧光定量PCR技术检测KAP11.1基因在不同绵羊皮肤毛囊中的表达情况。【结果】 3种绵羊KAP11.1基因CDS区序列为480 bp,编码159个氨基酸,为不稳定的疏水蛋白。相似性比对结果发现,与参照基因相比,2种类型和田羊基因序列相似性均为99.79％,均在423 bp处发生突变,由C变为T,卡拉库尔羊基因序列相似性为99.38％,其69 bp处G变为T、93 bp处C变为T、423 bp处C变为T。系统进化树分析发现,3种绵羊和山羊亲缘关系最近,和瘤牛亲缘关系最远。KAP11.1蛋白二级结构主要由无规则卷曲组成。试验成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并纯化得到19 ku的KAP11.1蛋白。KAP11.1基因在山区型和田羊和卡拉库尔羊皮肤毛囊中的表达量均显著高于平原型和田羊（P<0.05）,在山区型和田羊和卡拉库尔羊中差异不显著（P>0.05）。【结论】 克隆获得480 bp的绵羊KAP11.1基因CDS区序列,成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并获得19 ku的KAP11.1蛋白,且KAP11.1基因在3个品种绵羊皮肤毛囊中均有表达。     

Detection of enzootic nasal tumor virus (ENTV) in a sheep flock in southern Brazil

Enzootic nasal tumor (ENT) is a contagious neoplasm associated with enzootic nasal tumor virus (ENTV), which may induce disease in sheep (ENTV-1) and goats (ENTV-2). This study aimed to describe the occurrence of ENT in two Texel sheep (Ovis aries) from a 75-sheep flock, located in the city of Gravataí, southern Brazil. Animals used to be purchased from different origins, and no specific tests for disease monitoring or quarantine procedure were performed. Affected animals presented respiratory distress, anorexia with severe weight loss, and mucopurulent unilateral nasal discharge. Necropsy was performed in both animals and nasal cavity masses were observed. Histopathological analysis demonstrated an epithelial neoplasm compatible with nasal adenocarcinoma. PCR using a protocol that amplifies a 591 bp sequence of 5’LTR-gag region of ENTV1 was performed followed by DNA sequencing. Both samples were positive, and the sequences obtained presented highest identity (97%) with ENTV strain TN28 (GenBank accession number MH899613) detected in a Texel sheep from Scotland. This is the first report of ENTV-1 leading to enzootic nasal tumor in sheep in Latin America, which confirms the presence of the retrovirus in sheep flocks in the Brazilian territory.

     

新疆南疆和田羊、卡拉库尔羊毛囊KAP7基因的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在制备新疆南疆平原型和田羊、山区型和田羊与卡拉库尔羊3个地方品种（系）绵羊毛囊角蛋白关联蛋白7（keratin associated protein 7,KAP7）基因多克隆抗体,为探索毛囊KAP7基因对半粗毛羊羊毛产量与质量的影响奠定基础。以3个品种绵羊的皮肤毛囊为试验材料,提取总RNA,反转录得到cDNA,PCR扩增获得绵羊毛囊KAP7基因,构建pMD19-T-KAP7克隆质粒,对重组质粒进行PCR、酶切鉴定和序列分析,再构建pET-28a（+）-KAP7原核表达重组质粒,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,SDS-PAGE电泳检测原核表达的绵羊毛囊KAP7蛋白,经提取、纯化、回收得到目的蛋白,用其免疫家兔得到绵羊毛囊KAP7多克隆抗体血清,并用间接ELISA法检测其抗体效价。结果表明,与美利奴羊比对,平原型与山区型和田羊KAP7基因序列的同源性达99%,但平原型和田羊KAP7基因第22位碱基由G变为C,造成其KAP7蛋白第8位氨基酸由Gly变为Arg;山区型和田羊第70位碱基由A变为C,造成其24位氨基酸由Thr变为Ala;卡拉库尔羊毛囊KAP7基因与美利奴羊同源性达100%,其KAP7蛋白氨基酸序列与美利奴羊没有差异。绵羊毛囊KAP7基因原核表达重组质粒pET-28a（+）-KAP7可以在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达目的蛋白,其大小约为10 ku。利用绵羊毛囊KAP7蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体阳性血清具有免疫活性和特异性,其抗体效价达到1：10 000。