堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子的克隆和表达

本研究扩增和克隆了堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子,并在大肠杆菌中表达出MIF重组蛋白。根据GenBank中的MIF mRNA序列,设计特异引物,采用PCR方法以堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板扩增获得MIF基因,将MIF基因片段连接到原核表达载体pET-28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—MIF,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,对表达产物进行Western blot分析。结果从堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出MIF基因片段,长度为709bp;经序列分析,扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登录的MIF序列的同源性为99．5％;经SDS-PAGE检测表明重组质粒pET（28a）-MIF在大肠杆菌中以包涵体形式表达;Western blot分析证明堆形艾美耳球虫抗血清可与重组表达蛋白特异性结合。本研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子表膜单链抗体基因的构建

应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子表膜抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,再通过重叠延伸拼接（Splice overlap extension）PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入连接肽（Gly4Ser）3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至pMD18-T载体中进行测序。经测序,基因全长为744bp,编码248个氨基酸残基;经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。结果表明,成功构建了抗堆型艾美耳球虫子孢子表面蛋白抗体的ScFv基因。     

鸡毒害艾美耳球虫LZ株MIC5基因的重组表达及其表达产物的抗原性分析

根据已发表的鸡柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）微线蛋白5（Micronemeprotein5,MIC-5）基因的核苷酸序列设计引物,以毒害艾美耳球虫（E．necatrix）DNA为模板,利用PCR方法扩增出EnMIC-5部分基因片段。将基因片段与pMD18-Tsimple载体连接,重组质粒测序结果表明EnMIC-5基因大小为1470bp,编码490个氨基酸。EnMIC-5与pET-28a（＋）载体构建重组表达质粒pET-EnMIC-5,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,表达产物为相对分子质量约57．5ku的融合蛋白。Western-blot分析结果表明表达蛋白可被鸡感染E．necatrix阳性血清识别。用重组蛋白免疫昆明鼠,一免后15d即可检测到相应抗体,且抗体在三免后40d仍维持较高水平,证实重组蛋白具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。     

毒害艾美耳球虫蔗糖非酵解解旋酶2基因片段的克隆与原核表达

为了研究毒害艾美耳球虫蔗糖非酵解解旋酶2(SNF2)基因的功能,以提取的毒害艾美耳球虫子孢子总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增SNF2基因片段,克隆至pGEM-T-Easy载体,测序后构建pET30a-EnSNF2表达载体,转化大肠杆菌BL21,重组菌经测序鉴定后诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。结果显示:克隆的片段长822 bp,编码274个氨基酸;重组蛋白大小为36 ku左右,以包涵体形式为多,能被组氨酸(HIS)单抗特异性识别,表明该基因片段获得成功表达。研究结果为制备针对毒害艾美耳球虫SNF2的多抗和进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子ScFv-PE40重组毒素活性的测定

将诱导获得的可溶性表达产物抗堆型艾美耳球虫子孢子ScFv-PE40重组毒素,加入含有脱囊后的子孢子的1640培养液中,观察14 h内活动的子孢子数目和活动性的变化,结果与对照组相比,加入重组毒素组的活动子孢子数目明显减少(P<0.05),活动性明显降低,提示重组毒素对鸡堆型艾美耳球虫子孢子具有较强的杀灭作用.从而为鸡堆型艾美耳球虫病的免疫控制研究提供技术手段和理论依据.     

鸡堆型艾美耳球虫单链抗体基因的构建及表达

轻链可变区和重链可变区基因产物等摩尔浓度混合后,用重叠延伸拼接法扩增出单链抗体基因,再用带限制性内切酶位点的引物(NcoⅠ和HindⅢ)扩增出带有特定酶切位点的单链抗体基因片段.NcoⅠ和HindⅢ双酶切单链抗体与表达载体pET-22b( ),用回收试剂盒回收酶切后的单链抗体与表达载体pET-22b( )基因片段,用连接试剂盒将单链抗体与表达载体pET-22b( )基因片段连接,并将连接产物转化感受态细胞JM109.氨苄青霉素筛选阳性重组子.以T7promoter/T7terminator primer进行茼落PCR鉴定,测定正确后,37℃摇菌扩增,测菌浓度至D600为0.6时,加入IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE初步检测.SDS-PAGE检测显示其相对分子质量是31 000,与预期结果一致,证明单链抗体基因在大肠杆菌中得到表达.     

柔嫩艾美耳球虫rhomboid抗原基因在卡介苗中的克隆与表达

以含柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因的重组质粒为模板,应用PCR方法扩增该基因完整开放阅读框,克隆至pMD18-T载体中.分别用限制性内切酶Pst I/Cla I和Pvu II/Cla I进行双酶切,将rhomboid目的基因克隆到大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pRho-261和pRho-361.将重组质粒电穿孔转化卡介苗,经热诱导后对其表达产物进行SDS-PAGE和western blot分析.结果表明成功构建了两个重组质粒,其表达产物与柔嫩艾美耳球虫阳性血清具有免疫反应性,为重组卡介苗在鸡球虫病防治方面的研究奠定了基础.     

抗柔嫩艾美耳球虫ScFv-PE40重组毒素的活性测定

本试验采用ScFv-PE40重组免疫毒素(构建重组毒素时使用的是pET28a(+)表达载体,因其表达的蛋白产物N末端包含His-Tag,因此采用金属Ni2+亲和层析柱方法纯化该目的蛋白)来免疫健康无球虫海蓝小公雏,免疫后通过盲肠病变记分,克盲肠内容物卵囊数(OPG)、结合抗球虫指数(ACI)、增重等感染指标的测定,对重组免疫毒素对海蓝小公雏感染柔嫩艾美耳球虫的保护效果进行观察评价,为临床上控制鸡球虫病提供科学的依据.     

鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因的克隆与测序

提取堆型艾美耳球虫子孢子杂交瘤细胞总RNA,进行RT PCR,扩增出重链可变区基因。将已扩增出的鸡堆型艾美耳球虫特异性单抗重链可变区基因片段与pMD 18T载体连接,重组载体转化于感受态细胞JM109,筛选出阳性重组子,提取阳性重组子质粒并进行测序,得到单抗重链可变区的基因序列,为单链抗体基因的构建及免疫毒素的构建奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫泛素蛋白功能初步研究

泛素是真核生物中普遍存在的一种小分子蛋白,广泛参与细胞内蛋白质的平衡代谢过程,对维持细胞内环境的稳态具有重要作用.为研究泛素在柔嫩艾美耳球虫中的功能,本研究利用PCR方法克隆了柔嫩艾美耳球虫泛素(EtUb)基因,将其亚克隆至原核表达载体pET28a(+),转入大肠杆菌BL21,诱导表达制备rEtUb蛋白,用纯化的重组蛋...